[发明专利]一种Caco-2+NCI-H716与Beta-TC-6双层共培养细胞模型的构建方法及应用

权利要求书

1.一种Caco-2+NCI-H716与Beta-TC-6双层共培养细胞模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

(1)Caco-2细胞与Beta-TC-6细胞在DMEM培养基中培养，NCI-H716细胞在PRIM 1640培养基中培养，培养条件均为37℃，5％CO₂，两天更换一次培养基，四天传代一次；

(2)对Caco-2细胞进行稀释，获得浓度为6×10⁵cells/mL的细胞悬浮液，对NCI-H716细胞进行稀释，获得浓度为2×10⁵cells/mL的细胞悬浮液，按照1:1的体积比将Caco-2细胞和NCI-H716细胞的悬浮液混合获得共培养细胞混合悬浮液，随后在12孔细胞培养板的AP侧接种0.5mL共培养细胞混合悬浮液，BL侧添加1.5mL含15％胎牛血清的DMEM培养基；

(3)接种后每三天更换一次细胞培养基，接种第19天对步骤(1)获得的Beta-TC-6细胞进行稀释获得浓度为3×10⁵cells/mL的Beta-TC-6细胞悬浮液，取1.5mL添加在12孔细胞培养板的BL侧；

(4)接种21天时，通过Millicell ERS-2测量Caco-2与NCI-H716融合细胞单层的跨上皮电阻(TEER)，来评估融合细胞单层的完整性与致密性；

(5)分别将含与不含DPP-4抑制肽的KRB buffer加入12孔细胞培养板的AP侧与BL侧培养2小时，收集BL侧的上清液用于测定GLP-1与胰岛素含量。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述DMEM培养基中含有15％胎牛血清。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述PRIM 1640培养基中含有10％胎牛血清。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述细胞培养基为含15％胎牛血清的DMEM培养基。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)所述评估的方法为若跨上皮电阻高于500Ω·cm²，则说明Caco-2细胞单层致密完整可用于实验。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)所述DPP-4抑制肽包括IPYWTY、豌豆肽及其消化产物。

7.权利要求1-6任意一项权利要求所述构建方法在用于评价由DPP-4抑制肽导致的GLP-1分泌增加中的应用。

8.权利要求1-6任意一项权利要求所述构建方法在用于评价GLP-1介导的DPP-4抑制肽促进胰岛素释放效果中的应用。