[发明专利]一种用于检测达卡气单胞菌的引物组、试剂盒、方法及应用

说明书

本发明属于分子生物学领域，具体公开了一种用于检测达卡气单胞菌的引物组、试剂盒、方法及应用。该引物组包括上游引物DK1F和下游引物DK1R，上游引物DK1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物DK1R的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。本发明提供了一种新的遗传标记DK1作为达卡气单胞菌的新靶标，并设计了对应的引物组，基于该引物组提出的检测方法特异性强，灵敏度高，对于达卡气单胞菌的菌液检测灵敏度能够达到1.38cfu/μL，核酸检测灵敏度能够达到9.37×10^‑4ng/μL，能够快速准确的从多种生物和环境样品中检测达卡气单胞菌。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测达卡气单胞菌的引物组、试剂盒、方法及应用。

背景技术

达卡气单胞菌(Aeromonas dhakensis)分布于水环境中，是水产养殖动物最重要的细菌性病原之一，能够感染脊椎与非脊椎动物，也是引起人感染的常见菌。达卡气单胞菌曾被称为水族馆气单胞菌，是由Martínez-Murcia等于2008年首次在葡萄牙某水族馆的进口观赏鱼的皮肤上和鱼池的水中分离获得。其后陆续发现该菌在临床和环境中广泛流行。2013年，Beaz-Hidalgo等确定嗜水气单胞菌达卡亚种与水族馆气单胞菌为同一个种，且达卡亚种不同于嗜水气单胞菌的其他亚种，故把嗜水气单胞菌达卡亚种与水族馆气单胞菌进行了合并，正式命名为达卡气单胞菌，是一个新的种。有研究显示临床分离的达卡气单胞菌携带大量的毒力基因，如hlyA，GcaT，alt，act，exu，fla，lip，ahyB，aerA等。对血细胞系有极强的毒性，对肠细胞也有毒性作用。该菌种与嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌同源性较近，生化表型无明显区别，临床上常存在将达卡气单胞菌错误鉴定成嗜水气单胞菌或豚鼠气单胞菌，因此快速鉴定达卡气单胞菌具有一定的临床意义。

目前，主要是通过基因测序分子方法鉴定达卡气单胞菌，如利用gyrB、rpoD双基因测序鉴定，或16S rRNA和gyrB串联比较分析鉴定达卡气单胞菌。但基因测序方法耗时，成本也高，在操作上有一定的技术要求，不太适合临床大规模应用。因此需要一种快速准确简单的达卡气单胞菌鉴定方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，发明人利用在鱼体分离到达卡气单胞菌菌株202108B1，对其进行了全基因组测序，通过基因组比较分析，筛选达卡气单胞菌分子标记，寻找达卡气单胞菌共有的且与其他气单胞菌存在差异的序列片段，作为分子标记序列库，根据筛选得到的分子标记序列库，设计大量的引物进行试验验证，验证特异性和灵敏度，最终获得了特异性强、灵敏度高的鉴定达卡气单胞菌的分子标记和引物。具体技术方案如下：

一种用于检测达卡气单胞菌的引物组，所述引物组包括上游引物DK1F和下游引物DK1R，所述上游引物DK1F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物DK1R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物组的靶标基因为达卡气单胞菌的DK1，所述DK1的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所采用的上述新靶标DK1作为遗传标记，其存在于达卡气单胞菌中且具有一定的种间保守性，能特异性地鉴别达卡气单胞菌。根据上述新靶标DK1设计合成了上游引物DK1F和下游引物DK1R，其对于达卡气单胞菌的菌液检测灵敏度能够达到1.38cfu/μL，核酸检测灵敏度能够达到9.37×10^-4ng/μL。

本发明基于上述新靶标DK1和引物组的检测手段不仅能够将达卡气单胞菌与其它菌属如假单胞菌、沙门氏菌、杆菌、泛菌鉴别区分，还能将同属于气单胞菌属的例如嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌与达卡气单胞菌区分开来，特异性强。同时，还可以直接应用于菌液检测，无需DNA提取等步骤，简单易行，能够快读准确的从多种生物和环境样品中检测达卡气单胞菌。