[发明专利]一种用于检测NSE的适配体传感器及其使用方法

说明书

本发明属于生物检测领域，涉及适配体筛选和适配体传感器构建，特别是指一种用于检测NSE的适配体传感器及其使用方法。本申请中的高亲和力NSE适配体其Kd值为3.75 nM，对NSE具有非常高的亲和力，对NSE的检测限为2.6 nM，比以往报道的亲代适配体的检测限提高了6倍，且对NSE具有高特异性。利用该高亲和力适配体构建适配体传感器，为NSE的简单、快速、高灵敏检测提供了新方法，这对于体液中含量极微的其他靶标分子的灵敏检测具有重大的指导意义。本发明中高亲和力适配体的筛选方法对于医疗诊断、药物递送、食品质检、化工监测等领域中适配体的应用也具有强大的推进作用。

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及适配体传感器，特别是指一种用于检测NSE的适配体传感器及其使用方法。

背景技术

神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase，NSE）作为糖代谢过程的特异性关键酶之一，广泛分布于神经元和周围神经内分泌细胞中。临床医学研究表明，NSE蛋白水平在血清及脑脊液中的动态改变与神经系统疾病的严重程度、临床治疗及预后判断具有密切关系。在与神经内分泌组织起源有关的肿瘤，NSE 可以作为小细胞肺癌（SCLC）和神经母细胞瘤的肿瘤标志物，尤其是SCLC最敏感最特异的肿瘤标志物，与其临床分期呈正相关，被广泛应用于高危人群SCLC的筛查和诊断。

神经元特异性烯醇化酶被广泛认为是SCLC早期诊断和后续治疗的特异性预测因子。在正常人血清中NSE水平为5-12ng/mL，＞24ng/mL即可诊断为SCLC。截至目前，已有许多方法应用于NSE的检测，包括荧光免疫分析、放射免疫分析、质谱免疫分析、电泳、电化学检测、表面增强拉曼检测等，但上述方法仍在成本、时间和操作上存在些许不足。故寻找一种简便、快速和经济的检测方法至关重要。目前，检测SCLC的方法主要包括胸部X线、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)和正电子发射断层扫描(PET)。然而，这些方法通常不仅需要专门的大型仪器、专业的操作人员、高费用和长时间的诊断报告，而且还需要可检测的肿瘤直径大小≥10mm。这限制了在初级医疗机构和发展中国家对SCLC的早期诊断。因此，需要寻找一种快速、简便和经济的方法辅助诊断肺癌，提高肺癌的确诊率。

核酸适配体是指可与靶标分子特异性结合的单链寡核苷酸链分子，即DNA或RNA，长度一般为25-60个核苷酸，常被开发为生物传感器，用于快速、高灵敏的靶标分子检测。由于DNA相比于RNA的稳定性更好，应用更广泛。而且，与抗体相比，核酸适配体与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似，但作用的靶分子范围更广，甚至能够识别单抗不能区分的相似物质，比抗体具有更高的特异性和亲和力。因其结构和性能的独特优越性，核酸适配体日益广泛地应用于生物医学基础研究、疾病诊治和药物研发。

但是，关于核酸适配体的筛选还面临很多问题：

传统的适配体筛选方法为指数级富集配体系统进化技术(Systematic evolutionof ligands by exponential enrichment，SELEX)技术,主要包括单链随机序列核酸库的合成、随机序列核酸库与靶标的孵育结合、适配体一靶标复合物的分离、适配体从靶标上的洗脱、适配体的PCR扩增、利用PCR产物制备新的适配体库、用新适配体库重复上述步骤。一般需要20左右轮的筛选，最终通过核酸测序结合试验验证才能获得具有亲和力的核酸适配体，筛选过程比较复杂、劳动强度大、筛选成本高、耗时长，而且试验过程涉及到的有机试剂和危化品会对人体构成一定的危害。虽然SELEX技术已经做了很多方面的改良，但是这些问题依然没有得到解决。