[发明专利]一种可特异性清除MHCII+

权利要求书

1.一种可特异性清除MHCII⁺脂肪细胞的基因工程小鼠的制备方法：

(1)构建H2-Aa^DTR小鼠：在C57BL/6J小鼠的H2-Aa基因上进行基因编辑，在H2-Aa基因最后一个外显子(第4外显子)后插入一个-loxP-eGFP-STOP-loxP-DTR-mCherry-片段，其中loxP位点是Cre重组酶识别并结合的序列，eGFP是加强型绿色荧光蛋白，STOP是转录终止序列，能够阻断后面基因的转录，DTR是白喉毒素受体，mCherry是一种红色荧光蛋白，该小鼠中表达H2-Aa基因(即表达MHCII)的细胞将表达eGFP荧光蛋白，而不表达DTR和mCherry，得到H2-Aa^DTR小鼠；

(2)将H2-Aa^DTR小鼠与Adipoq-cre小鼠杂交后得到aH2-Aa^DTR小鼠：该小鼠的脂肪细胞能够表达Cre重组酶，Cre重组酶识别loxP位点并将两个loxP位点间的DNA序列切断，可以同时表达H2-Aa基因和Cre基因的细胞，即能够表达DTR和mCherry荧光蛋白的所述可特异性清除MHCII+脂肪细胞的基因工程小鼠，即aH2-Aa^DTR小鼠。

2.如权利要求1所述的可特异性清除MHCII⁺脂肪细胞的基因工程小鼠的制备方法，还包括以下步骤：

(3)aH2-Aa^DTR小鼠通过与纯种C57BL/6J小鼠杂交5代纯化遗传背景后得到纯化后的可特异性清除MHCII⁺脂肪细胞的基因工程小鼠。

3.一种MHCII⁺脂肪细胞：

所述MHCII⁺脂肪细胞从权利要求1或2中的aH2-Aa^DTR小鼠的脂肪组织、其他动物或人类的脂肪组织中通过流式分选或磁珠分选获得。

4.如权利要求3所述的MHCII⁺脂肪细胞，其特征在于：

从其他动物或人类的脂肪组织中通过磁珠分选获得的具体方法为：

(1)获取动物或人类的脂肪组织；

(2)脂肪细胞的提取：用手术剪将脂肪组织剪碎至大约1mm³小块，每克脂肪组织加5mL胶原酶II缓冲液在37℃、100rpm下消化45分钟，动物脂肪组织用200μm滤网，人类脂肪组织用300μm滤网过滤，将过滤后的细胞悬液，200g速度离心1分钟，脂肪细胞将漂浮在上层，下层沉淀是血管基质组分；

(3)用巴氏吸管吸取上层脂肪细胞转移到新的管子中，加入5mL 2mM EDTA溶液，上下颠倒轻轻晃动管子5分钟洗涤脂肪细胞，200g速度离心1分钟，去掉下层液体，重复上述步骤3次，得到脂肪细胞；

(4)将获得的脂肪细胞，分为200μL一份，加入200μL CD45抗体工作液，所述CD45抗体工作液是200μL含2mM EDTA和1％BSA的PBS加入2μL生物素藕联的抗小鼠CD45抗体制得的，室温孵育15分钟；

(5)加入1mL PBS，洗涤一次，200g离心1分钟；

(6)加入200μL磁珠悬液，室温孵育15分钟；

(7)将装有细胞悬液的管子，置于磁力架上，CD45⁺细胞将会与磁珠结合并被吸附在管壁上，以此来去除CD45⁺细胞，吸取未被磁珠吸附的细胞，并转移到新的管子中；

(8)加入200μL MHCII抗体工作液，MHCII抗体工作液是200μL含2mM EDTA和1％BSA的PBS加入2μL生物素藕联的抗小鼠MHCII抗体制得，室温孵育15分钟；

(9)加入1mL PBS，洗涤一次，200g离心1分钟；

(10)加入200μL磁珠悬液，磁珠悬液是200μL含2mM EDTA和1％BSA的PBS加2.5μL生物素结合剂磁珠制得，室温孵育15分钟；

(11)将装有细胞悬液的管子，置于磁力架上，MHCII⁺脂肪细胞将会与磁珠结合并被吸附在管壁上，先将未被磁珠吸附的MHCII^-脂肪细胞充分移除，剩下的MHCII⁺脂肪细胞，用2mMEDTA和1％BSA的PBS洗涤三遍，最后得到的MHCII⁺脂肪细胞和MHCII^-脂肪细胞。