[发明专利]基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用

说明书

本发明属于基因组学及基因工程和生物技术领域，具体涉及基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用。本发明中基于TnpB的基因编辑系统只需要构建一个含tnpB基因及其3’非翻译区和供体DNA片段的质粒。利用在源宿主中TnpB蛋白与来源于其自身基因的向导RNA形成的效应复合物对靶向位点产生特异性切割，并且以质粒上供体DNA为模板，通过同源重组修复完成靶向位点的精确编辑。上述方法具有基因编辑效率高、蛋白表达兼容性强、载体构建简单、适用于单碱基基因组编辑、可应用宿主范围广等优点，因此具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于基因组学及基因工程和生物技术领域，具体涉及基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

以CRISRP-Cas系统编码的可编程RNA引导核酸酶为代表的核酸酶(Cas9以及Cas12等)在微生物基因组编辑中的应用极大加速了微生物合成生物学等领域的发展(Yao etal.,2018)。然而当前可以的CRSPR核酸酶在微生物基因组编辑中的应用依然存在以下局限性和挑战。(a)目前常用的单亚基核酸酶Cas9和Cas12普遍存在蛋白尺寸大以及Cas9蛋白表达毒性的问题。(b)Cas9和Cas12会对未成功编辑的细胞产生持续靶向切割，从而极大减少了转化子数目。(c)Cas9和Cas12在单碱基编辑中的局限性。(d)CRISPR系统引导RNA与蛋白编码序列需要独立表达，这增加了遗传操作的难度。(e)当前多数开发的CRISPR-Cas系统仅能在常温微生物中应用，能够适用于高温微生物的系统亟待开发。鉴于以上问题，亟待新型可编程核酸酶的开发与应用。

2021年，Science和Nature杂志同时报导了细菌IS200/605转座子编码的转座相关蛋白TnpB为一种新型的可编程RNA引导核酸酶(Karvelis et al.,2021；Altae et al.,2021)。这种蛋白能够特异性识别并切割双链DNA，然而其蛋白大小仅为400个氨基酸左右，比常用Cas9和Cas12核酸酶大小小一倍以上，代表了一类新型的微型可编程核酸酶。另外与CRISPR系统不同的是：TnpB的引导RNA由其自身基因以及其基因3’端紧邻的非编码区域编码，这表明TnpB系统的RNA组分的构建与表达将更加容易。目前耐辐射奇球菌的TnpB蛋白在哺乳动物细胞系中能够引起小片段DNA的插入与缺失，揭示了TnpB蛋白在基因组编辑中的潜力(Karvelis et al.,2021)。然而TnpB系统是否能够在普遍缺失非同源末端连接修复途径的微生物中进行基因编辑尚未得到研究。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统及其构建方法和应用。具体的，本发明通过对冰岛硫化叶菌Rey15A中TnpB蛋白的研究提出了TnpB在源宿主高保真基因组编辑中的应用，并提供了TnpB系统的构建方法及基因编辑流程。本发明中的TnpB编辑系统只需要构建一个含有TnpB蛋白、3’端非编码区域和16nt的引导序列、以及供体DNA片段的质粒。极大简化了编辑载体的构建。利用质粒编码的TnpB和引导RNA自发形成的效应复合物对基因组靶向位点进行切割，通过质粒上的供体DNA模板为细胞内的同源重组修复过程提供模板，从而实现靶向位点的精确编辑。更为重要的是，该TnpB编辑系统能够用于微生物单碱基基因组编辑，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种基于微型RNA引导核酸酶TnpB的基因编辑载体系统，所述基因编辑载体系统包含编辑质粒，所述编辑质粒至少含有TnpB编码基因序列、3’端非编码区和引导序列、以及供体DNA片段；

其中，所述引导序列为靶向位点对应序列克隆至TnpB编码基因3’端非编码区保守序列之后获得；所述引导序列长度为13-24nt；