[发明专利]用于检测HBV基因T216C突变位点的引物和探针

说明书

本发明属于生物检测方法技术领域，具体涉及一种用于检测HBV基因T216C突变位点的引物和探针。本发明提供了用于检测HBV基因T216C突变位点的引物和探针包括由SEQ NO:1所示的正向引物、由SEQ ID:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针。用于步骤(2)检测HBV基因保守序列的引物和探针包括由SEQ NO:4示的正向引物、由SEQ ID:5所示的反向引物、由SEQ ID NO:6所示的探针。

本申请为申请日为2020年9月30日、申请号为2020110664254、名称为“一种基于微滴式数字PCR技术的乙型肝炎病毒T216C突变检测方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物检测方法技术领域，具体涉及一种基于微滴式数字PCR技术的乙型肝炎病毒T216C突变检测方法。

背景技术

乙型病毒性肝炎仍是一个世界性的公共卫生问题，乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus,HBV)相关的慢加急性肝衰竭(acute on chromc liver failure，ACLF)是慢性肝炎患者死亡的重要原因。长期以来宿主免疫一直被认为是乙型肝炎加剧的主要原因，但是近年的研究结果表明病毒因素在ACLF的发病中同样起重要作用。HBV是嗜肝病毒家族的一员，其基因组全长约为3200个核苷酸，包含4个相互重叠的开放性读码框，分别编码HBV表面抗原、核心抗原、聚合酶和多功能的非结构性蛋白X。由于HBV的复制过程包含前基因组RNA的逆转录，其逆转录酶缺乏校正功能，故HBV的突变率显著高于其它的DNA病毒。HBV基因组的突变率可随着病毒的复制不断增加，其中一些突变可能与慢性肝炎的急性加剧相关，可作为ACLF的预警的生物标志物和抗病毒治疗的靶标。有研究通过收集ACLF样本，利用HBV全基因组测序筛选出与ACLF发病相关的HBV突变，发现T216C突变为ACLF发生的独立危险因素，可作为预测乙型肝炎加剧的分子标志物，为阻止ACLF发病和改善HBV感染者的预后提供依据。

数字PCR(Digital PCR)技术是一种核酸分子绝对定量技术，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，与传统的荧光定量相比，数字PCR有更高的灵敏度、特异性和精确性。由于数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点，完全不依赖于Ct值，因此数字PCR反应受扩增效率的影响大大降低，对反应抑制物的耐受能力大大提高；数字PCR标准反应体系分配的过程可以极大程度上降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度，因此数字PCR技术适用于在复杂背景中检测稀有突变，在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面具有明显的优势。微滴式数字PCR仪是将含有核酸分子的反应体系形成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应器。经PCR扩增后，采用微滴分析仪对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理可计算给出检测分子的浓度或拷贝数。

突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system,ARMS)是Newton等首先建立用来检测已知突变的方法。在一定条件下，PCR引物3'未端的错配导致产物的急剧减少,针对不同的已知突变，设计适当的引物可以通过PCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。ARMS技术即针对突变位点设计引物，将需检测的突变位点置于引物的3’端，突变引物扩增野生型模板时会被阻滞，不能有效扩增。该系ARMS技术具有高特异性和高灵敏度，已用于多种疾病的点突变的检测。

本发明将突变扩增阻滞系统和数字PCR系统结合起来，开发具有高灵敏度和高特异性的能够绝对定量的突变检测方法。

发明内容