[发明专利]用于水稻基因编辑的MAD7-NLS融合蛋白、载体及其应用

说明书

本发明公开了一种用于水稻基因编辑的MAD7‑NLS融合蛋白、载体及其应用，MAD7蛋白的N端增加1个核定位信号肽氨基酸序列，在C端增加1个核定位信号肽氨基酸序列，得到MAD7‑NLS融合蛋白。MAD7‑NLS融合蛋白的CrRNA表达盒子包括基因编辑靶点、启动子和MAD7蛋白的两种CrRNA序列，分别为35nt‑CrRNA和21nt‑CrRNA，CrRNA的核苷酸序列3’端分连接有1个tRNA序列。在水稻遗传转化筛选阶段42℃处理4h水稻愈伤组织能够显著的提高MAD7核酸酶的基因编辑效率，MAD7突变类型多数为6‑50nt的删除。完整表达载体含有上述CrRNA表达盒子和MAD7‑NLS融合蛋白的核苷酸序列，上述表达载体能够高效实现水稻基因的敲除编辑。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及用于水稻基因编辑的MAD7蛋白及其表达载体和表达盒子。

背景技术

MAD7是美国INSCRIPTA公司开发的一种Type V-a型CRISPR-Cas蛋白之一，是从直肠真杆菌(Eubacterium rectale)中发现的蛋白，已经广泛应用于动植物、微生物基因编辑中。MAD7与毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)的LbCpf1、来自弗朗西斯菌(Francisella novicida)的FnCpf1、来自氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)的AsCpf1都是同一家族的同源基因，虽与AsCpf1同源性只有31％，但是PAM位点识别区域高度相似。MAD7的有效识别PAM位点为“YTTN”，基因编辑特点和多少Cas12a系列核酸酶类似，PAM位点识别多以富含“T/A”，CrRNA一般21nt，剪切位置远离PAM位点端，剪切类型为粘性末端剪切，基因组突变类型多以中8bp以上的缺失为主。

MAD7蛋白有1263个氨基酸，148kDa左右，比常用的来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)SpCas9的蛋白小(含有1368个氨基酸)，有利于基于载体递送的转化方式。INSCRIPTA公司开发的MAD7已经在大肠杆菌，酿酒酵母以及动物细胞系中测试过，证明它在基因编辑应用中的有效性。

现有技术中，文献《Expanding and understanding the CRISPR toolbox forBacillus subtilis with MAD7 and dMAD7》(Price M A,Cruz R,Bryson J,et al)中公开了利用基于MAD7的基因编辑方式，应用于枯草芽孢杆菌基因编辑，编辑效率可达90％以上，还设计了MAD7失活突变体(dMAD7、D877A、E962A和D1213A)，创造了基于dMAD7的CRISPRi技术，并在枯草芽孢杆菌测试有显著效果。文献《Genome editing in plants with MAD7nuclease》(Lin Q,Zhu Z,Liu G,et al)中公开了把MAD7应用于水稻和小麦基因编辑，该核酸酶在植物中的编辑效率一般，比较高的编辑效率也只能达到65％，研究者通过MAD7变体和APOBEC3A融合，建立了基于MAD7的ABE碱基编辑技术，并成功应用于水稻和小麦基因编辑领域。

综上所述，即使MAD7在水稻中的应用已有报道，但为了满足水稻基因工程的需要，丰富水稻基因编辑的工具箱，有必要开发出效率更高的基因编辑系统。

发明内容

针对以上现有技术的不足，本发明提供了编辑效率更高的MAD7-NLS融合蛋白及其表达盒子和完整表达载体，丰富了水稻基因编辑的工具箱。

本发明的另一目的是提供MAD7-NLS融合蛋白完整表达载体的应用，包括抗愈伤组织的筛选和抗愈伤组织的处理等步骤，显著提高了MAD7在水稻基因编辑中的效率。

为了实现上述目的，本发明探索了MAD7核酸酶在水稻基因编辑体系中的应用，从根据水稻密码子的偏好对MAD7核苷酸序列进行优化，到表达载体的结构、水稻遗传转化的条件等方面优化，综合设计提高MAD7在植物基因编辑中的效率，提升MAD7在植物基因编辑育种的应用。具体通过以下技术实现。