[发明专利]高产葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌中携带葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因。

2.根据权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因是通过对野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述丙酮酸激酶基因是通过对野生型毕赤酵母丙酮酸激酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；

任选地，所述丙酮酸激酶基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因是通过连接至第一表达载体上导入毕赤酵母；所述丙酮酸激酶基因是通过连接至第二表达载体上导入毕赤酵母；

任选地，所述第一表达载体选自pGAPZαA；

任选地，所述第二表达载体选自pPIC9K；

任选地，所述pPIC9K预先被去除α-factor信号肽序列。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述毕赤酵母工程菌；和/或

所述试剂盒包括：

第一表达载体，所述第一表达载体携带有葡萄糖氧化酶基因；

第二表达载体，所述第二表达载体携带有丙酮酸激酶基因。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因是通过对野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述丙酮酸激酶基因是通过对野生型毕赤酵母丙酮酸激酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；

任选地，所述丙酮酸激酶基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；

任选地，所述第一表达载体选自pGAPZαA；

任选地，所述第二表达载体选自pPIC9K；

任选地，所述pPIC9K预先被去除α-factor信号肽序列。

5.一种获得权利要求1或2所述毕赤酵母工程菌的方法，其特征在于，包括：

将携带有葡萄糖氧化酶基因的第一表达载体导入毕赤酵母，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为初筛菌株；

将携带有丙酮酸激酶基因的第二表达载体导入所述初筛菌株，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为目标毕赤酵母工程菌。

6.一种提高毕赤酵母的葡萄糖氧化酶产量的方法，其特征在于，包括：

使毕赤酵母携带葡萄糖氧化酶基因和丙酮酸激酶基因。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶基因来源于黑曲霉；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因是通过对野生型黑曲霉葡萄糖氧化酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述丙酮酸激酶基因是通过对野生型毕赤酵母丙酮酸激酶基因进行优化而获得的；

任选地，所述葡萄糖氧化酶基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列；

任选地，所述丙酮酸激酶基因具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或与其具有至少80％同源性的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

将携带有葡萄糖氧化酶基因的第一表达载体导入毕赤酵母，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株，作为初筛菌株；

将携带有丙酮酸激酶基因的第二表达载体导入所述初筛菌株，进行培养，筛选出葡萄糖氧化酶产量最高的菌株并收集菌株中的葡萄糖氧化酶；

任选地，所述第一表达载体选自pGAPZαA；

任选地，所述第二表达载体选自pPIC9K；

任选地，所述pPIC9K预先被去除α-factor信号肽序列。