[发明专利]一种检测非洲猪瘟的单链抗体、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测非洲猪瘟的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体由组装scFv基因所表达，所述组装scFv基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种制备如权利要求1或2所述的单链抗体的方法，其特征在于，所述方法包括：

以第一预设扩增引物组对K205R基因进行扩增，并对扩增产物进行重组表达载体的构建，后进行K205R蛋白的诱导表达和纯化，得到K205R蛋白；

采用所述K205R蛋白进行器官的免疫，后进行RNA提取，并进行反转录，得到cDNA片段；

采用第二预设引物组对所述cDNA片段进行扩增，后以第三预设引物组进行组装，得到scFv基因；

连接噬菌粒与所述scFv基因，得到重组载体；

向感受态细胞中转入所述重组载体，后进行亲和性淘选，得到多个特异性单链抗体；

分析所述特异性单链抗体和抗原的结合能力，确定最佳结合能力的特异性单链抗体；

使所述最佳结合能力的特异性单链抗体进行表达，得到单链抗体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第二预设引物组包括扩增重链可变区的上游引物VHF-SfiⅠ和扩增轻链可变区的下游引物VLR-NotⅠ；其中，所述上游引物VHF-SfiⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游引物VLR-NotⅠ的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第三预设引物组包括重链可变区的连接引物VHR-Linker和轻链可变区的连接引物VLF-Linker；其中，

所述连接引物VHR-Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述连接引物VLF-Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

6.一种检测非洲猪瘟的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的单链抗体和K205R蛋白。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述K205R蛋白的制备方法包括：

以第一预设扩增引物组对K205R基因进行扩增，并对扩增产物进行重组表达载体的构建，后进行K205R蛋白的诱导表达和纯化，得到K205R蛋白。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第一预设扩增引物组包括上游引物KF和下游引物KR，所述上游引物KF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述下游引物KR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

9.一种间接竞争ELISA技术检测非洲猪瘟的方法，其特征在于，所述方法包括：

采用如权利要求6-8任一项所述的试剂盒中的K205R蛋白和单链抗体进行ELISA棋盘格滴定实验，确定包被抗原的最佳质量浓度和检测用单链抗体的最佳稀释倍数；

根据所述最佳质量浓度和所述最佳稀释倍数，确定猪只血清的最佳稀释度、最佳竞争时间和最佳显色时间；

根据所述最佳质量浓度、所述最佳稀释倍数、所述最佳稀释度、所述最佳竞争时间和所述最佳显色时间，进行待测猪只血清的间接竞争ELISA检测；

根据所述间接竞争ELISA检测的结果是否呈阳性，确定猪只是否感染非洲猪瘟；

若所述间接竞争ELISA检测的结果为阳性，则判定猪只感染非洲猪瘟。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述采用所述K205R蛋白和所述检测用单链抗体进行ELISA棋盘格滴定实验，确定包被抗原的质量浓度和检测用单链抗体的稀释倍数，具体包括：

采用不同稀释倍数的所述检测用单链抗体分别混合非洲猪瘟阳性血清和非洲猪瘟阴性血清，得到阳性混合液和阴性混合液；

包被不同浓度的所述K205R蛋白于检测容器中，并进行封闭，后向所述检测容器中分别加入所述阳性混合液和所述阴性混合液，并进行竞争反应；

向所述检测容器中加入底物显色液进行显色，后加入终止液终止反应，测定所述反应容器中的吸光度数据；

根据所述吸光度数据与预设值的差异，确定包被抗原的最佳质量浓度和检测用单链抗体的最佳稀释倍数。