[发明专利]基于HR-MS和NMR的HSCCC溶剂系统筛选方法

说明书

本发明公开了基于HR‑MS和NMR的HSCCC溶剂系统筛选方法。具体包括HSCCC待分离样品制备、HPLC分析、HR‑MS分析、NMR分析及溶剂系统筛选。本发明方法主要针对HPLC无法分辨的化合物的溶剂系统的筛选问题，此类化合物无法通过HPLC进行分配系数测定。通过本发明方法可以很好分辨分布在同一HPLC色谱峰中的化合物，并基于特征supgt;1/supgt;H‑NMR信号进行分配系数的测定来筛选溶剂系统；另外本发明所筛选的HSCCC溶剂系统可用于HSCCC分离中，可以有效拓展HSCCC的应用范围，属于从无到有的原始创新。

技术领域

本发明涉及天然产物分离纯化技术领域，具体涉及基于HR-MS和NMR的HSCCC溶剂系统筛选方法。

背景技术

高速逆流色谱(HSCCC)是一种新型的液-液分配色谱技术，无固体载体作为固定相，因此不存在液-固色谱中存在的样品死吸附问题，可100％回收样品，优势明显。此外，近年来陆续开发出循环洗脱、中心切割、等度洗脱、梯度洗脱，pH区带等多种洗脱方式，极大的拓宽了HSCCC的应用范围，已被广泛应用于黄酮、生物碱、酚酸类、蒽醌类、皂苷、萜类、木脂素、蛋白质、糖类等重要的活性天然产物的分离制备。

HSCCC分离的关键是需要一个合适的溶剂系统，分配系数K和分离因子α是溶剂系统筛选的两个关键参数。一般来说，K和α应满足：0.2≤K≤5，α≥1.5。目前，HPLC技术是最常用的也是最新的溶剂系统筛选技术。但前提是，目标化合物在HPLC上可以实现有效的分离。如果两个或更多化合物存在于同一个HPLC色谱峰中，HPLC技术无法进行分配系数的测定。然而，这种共洗脱的现象在天然产物领域是比较常见的。因此，急需开发出一种针对此类共洗脱化合物分配系数的测定方法来筛选溶剂系统，进行HSCCC分离。

发明内容

基于上述技术问题，本发明的目的是提供基于HR-MS和NMR的HSCCC溶剂系统筛选方法。

本发明保护基于HR-MS和NMR的HSCCC溶剂系统筛选方法，具体包括如下步骤：

步骤1，制备样品：取青稞幼苗，切成1cm小段，加入150L 30％乙醇80℃下热回流提取2次，每次2h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，上AB-8大孔树脂；先后用去离子水、20％乙醇、30％乙醇、50％乙醇洗脱5BV；取30％乙醇洗脱液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥，得到30％乙醇部位；取30％乙醇部位，注入DAC100制备液相色谱，用40％甲醇等度洗脱，得到HSCCC待分离样品；

步骤2，HPLC分析：将步骤1的待分离样品注入HPLC分析，色谱条件：Platisil ODSC18色谱柱(250×4.6mm id,5μm)；流动相：甲醇-水，0-30min，10％-45％乙腈；流速，1.0mL/min；柱温30℃；检测波长，270nm；

步骤3，HR-MS分析：将步骤1的待分离样品注入HR-MS分析，质谱条件：SCIEX的Triple TOF 6600Plos质谱仪，采用TurbolonSpray离子源，气帘气30psi，离子源载气150psi，离子源载气260psi，离子源温度550℃；IDA正离子模式；喷雾电压5500V；CAD载气7psi，一级TOF MS质量扫描范围50-1500Da，诱导碰撞电压10V；二级TOF MS质量扫描范围50-1500Da，诱导碰撞电压45V，在正离子或负离子模式下提取化合物MS及MS/MS信息，通过MassBank database数据库，筛选匹配得分最高的化合物；

步骤4，NMR分析：将步骤1的待分离样品用DMSO溶解，注入NMR分析，分析条件：采用600MHz核磁共振仪，采集参数：zg30脉冲序列，32K数据点，扫描次数64次，弛豫延迟时间13s，谱图宽度16ppm；提取¹H-NMR和COSY谱图，合所述步骤3中化合物结构，筛选¹H-NMR的特征信号，作为分配系数测定定量依据；