[发明专利]一种醇脱氢酶突变体及应用

说明书

本发明公开了一种醇脱氢酶突变体及应用，该醇脱氢酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第258位天冬酰氨突变成半胱氨酸获得。本发明发现了影响醇脱氢酶活性的一个关键氨基酸残基，以来源于Corynebacterium glutamicum的(2S,3S)‑2,3‑丁二醇脱氢酶(BDH，NCBI登录号：WP_211439413)为基础，通过理性设计的分子改造方法，来解决该野生型酶对天然或者非天然底物没有酶活或酶活较低的问题，获得的突变体可以催化制备具有极高光学纯度的手性二醇(2S,5S)‑2,5‑己二醇和(2S,3S)‑2,3‑丁二醇为生物转化生产医药前体(2S,5S)‑2,5‑己二醇和(2S,3S)‑2,3‑丁二醇提供了广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种醇脱氢酶突变体及应用。

背景技术

手性二醇是一类十分重要的化合物，在药物合成、农业化学品合成、功能性材料制备、香料和精油添加剂等方面都具有十分重要的用途。化学法制备手性二醇反应步骤复杂繁琐，催化剂昂贵且有毒、对环境不友好。生物法催化双酮不对称还原合成手性二醇因其良好的催化活性、立体选择性和环境友好等优点受到国内外研究者们的重视。(2S,3S)-2,3-丁二醇包含两个邻位手性中心的化合物，是不对称合成的基石，也可用于生产印刷油墨和溶剂。(2S,5S)-2,5-己二醇作为一种具有特定基团的光学活性醇，是合成许多手性药物和其他手性化学品的重要手性砌块，在医药和化工领域具有广泛的应用前景。

(2S,3S)-2,3-丁二醇脱氢酶(butanediol dehydrogenase,EC 1.1.1.304)是合成(2S,3S)-2,3-丁二醇的关键酶，参与(2S,3S)-2,3-丁二醇的合成与分解代谢，广泛存在于所有生命体中。(2S,3S)-2,3-脱氢酶由于其来源广，立体选择性严格等特点，在手性二醇合成领域具有极大的应用价值和潜力。但野生的(2S,3S)-2,3-丁二醇脱氢酶对于天然底物(2S,3S)-2,3-丁二醇的活性很低、无法满足于工业应用，并且具有很强的底物专一性，对(2S,5S)-2,5-己二醇活性几乎没有活性。因此，通过分子改造提高野生型(2S,3S)-2,3-丁二醇脱氢酶催化生产(2S,3S)-2,3-丁二醇和(2S,5S)-2,5-己二醇的催化能力，有助于其更好的进行工业应用。

鉴于此，还需要进一步深入研究，通过基于结构的酶设计，来解决NAD(H)特异性的(2S,3S)-2,3-丁二醇脱氢酶催化生产(2S,3S)-2,3-丁二醇和(2S,5S)-2,5-己二醇没有酶活或酶活较低的问题。

发明内容

本发明提供了一种醇脱氢酶突变体及应用，该醇脱氢酶突变体解决了来源于(Corynebacterium glutamicum)的原始(2S,3S)-2,3-丁二醇脱氢酶(氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)对前手性双酮没有酶活或酶活较低的问题，提供了一种(2S,3S)-2,3-丁二醇脱氢酶突变体以及该突变体在制备不同(2S,5S)-2,5-己二醇和(2S,3S)-2,3-丁二醇的应用。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种醇脱氢酶突变体，所述突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第258位天冬酰氨突变成半胱氨酸获得。

本发明对来源于Corynebacterium glutamicum的(2S,3S)-2,3-丁二醇脱氢酶(BDH，NCBI登录号：WP_211439413，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)的突变体(N258C)进行AlphaFold 2四聚体建模，链A和链D以及链B和链C之间的C258形成两对链间二硫键，增加了多聚体结合的稳定性，提高酶对前手性双酮的活性；并针对其他的非天然底物进行活性测定以扩展该突变体的应用。其中，N258C表示：第258位，即该酶最后一个氨基酸由天冬酰胺突变为半胱氨酸。

本发明还提供了一种所述醇脱氢酶突变体的编码基因。