[发明专利]一种生物催化合成芳香化合物的方法

说明书

本发明公开了一种生物催化合成芳香化合物的方法，涉及芳香化合物的合成领域，所述方法利用底物通过全细胞反应液催化合成芳香化合物；底物为丁香酚或丁香油，全细胞反应液含有基因工程大肠杆菌；基因工程大肠杆菌由重组质粒构建；芳香化合物为阿魏酸和\或松柏醇和\或4‑乙烯基愈创木酚和\或香兰素。本发明提供的生物催化合成芳香化合物方法避免了辅因子的依赖，因而可以利用构建的全细胞催化体系或者高密度发酵转化木质素源的丁香油或丁香酚来高效合成多种高价值芳香化合物，极大的提高了生产效率，获得的香兰素产量是目前报道的以丁香酚为底物来生产香兰素的最大产量，具有重要的现实意义和工业应用价值。

技术领域

本发明涉及芳香化合物的合成领域，尤其涉及一种生物催化合成芳香化合物的方法。

背景技术

生物基材料由于其可生物降解、可循环性以及低碳等优势，已逐渐占领高分子化学的未来市场，如芳香醛和醇单体是生物基聚合物主链的关键组成部分，可以增加聚合物的刚性、疏水性和耐火性。然而，芳香族单体主要以不可再生石油为原料利用化学合成方式进行生产。因此，利用木质素废料等可再生资源合成高附加值的芳香族化合物已引起广泛关注。

香兰素是一种芳香醛，是热固性树脂/热塑性塑料的重要前体。此外，它已广泛应用于香精、香料和医药中间体。然而，目前香兰素的天然提取、化学合成等生产方法已不能满足市场需求。与此同时，化学合成也会引发环境污染。因此，香兰素的微生物合成由于其反应条件温和、污染少和可以利用农业废弃物等优点，在提供有效替代路线方面具有广阔的前景。目前，利用阿魏酸、异丁香酚等不同的可再生底物，以绿色环保的方式通过微生物生产香兰素已经取得了长足的进步。

与香兰素生产的其他碳源相比，丁香酚作为一种木质素单体，由于其经济和商业价值较低且成本较低，被认为是一种更理想的底物，天然存在于丁香油、丁香罗勒油以及肉桂油等精油中。虽然有些研究表明一些菌株可以天然以丁香酚为碳源进行香兰素的生产。然而，较长的代谢途径导致香草醛的浓度很低。此外，香草醛可进一步氧化成其下游产物香草酸，难以积累。随着合成生物学的发展，它可以通过基因操作方式将香兰素的天然生产途径转移到可进行遗传操作的重组菌株中来增加天然产物的产量。但尽管Overhage等人在大肠杆菌中构建了从丁香酚到香兰素的通路，然而由于通路中各个酶的不适配性，使得香兰素的合成需要两步反应。另外由于对ATP和辅酶A的持续需求严重阻碍了催化反应的效率。因此，需要构建新的生物转化体系，可以在不依赖辅因子的条件下将丁香酚一步高效转化为香兰素。然而，目前并未有不依赖辅因子的这种生物催化剂的报道。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种转化效率高，从丁香酚到香兰素一步法合成的生物催化合成芳香化合物的方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种转化效率高，从丁香酚到香兰素一步法合成的生物催化合成芳香化合物的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种生物催化合成芳香化合物的方法，利用底物通过全细胞反应液催化合成芳香化合物；底物为丁香酚或丁香油，全细胞反应液含有重组大肠杆菌；重组大肠杆菌由重组质粒构建；芳香化合物为阿魏酸和\或松柏醇和\或4-乙烯基愈创木酚和\或香兰素。

进一步地，上述方法包括如下步骤：

步骤1、合成催化酶基因并制备重组质粒；

步骤2、利用步骤1得到的重组质粒构建重组大肠杆菌；

步骤3、利用步骤2得到的重组大肠杆菌制备全细胞催化剂；

步骤4、将步骤3得到的全细胞催化剂添加底物，进行发酵，得到发酵液；

步骤5、从步骤4获得的发酵液中提取芳香化合物，并进行检测。