[发明专利]一种融合抗原GLuc-p30及其制备方法、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种融合蛋白GLuc-p30，其特征在于：所述融合蛋白GLuc-p30的氨基酸序列如SEQID No.1所示；所述融合蛋白GLuc-p30的编码基因序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种制备如权利要求1所述融合蛋白GLuc-p30的方法，其特征在于：所述方法的步骤如下：

步骤S1：构建表达融合抗原GLuc-p30的重组慢病毒质粒pLVX-CMV-GLuc-p30；

步骤S2：经转染包装表达融合抗原GLuc-p30的慢病毒后，转导HEK-293T细胞，筛选稳定表达GLuc-p30的细胞株，培育细胞株收集培养上清，即获得融合抗原GLuc-p30。

3.根据权利要求2所述的制备融合蛋白GLuc-p30的方法，其特征在于：所述步骤S1的具体步骤如下：将GLuc-p30的编码基因克隆到慢病毒载体pLVX-CMV中；PCR扩增GLuc-p30编码序列，分别用PmeⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点进行连接以构建重组慢病毒质粒pLVX-CMV-GLuc-p30。

4.根据权利要求2所述的制备融合蛋白GLuc-p30的方法，其特征在于：所述步骤S2的具体步骤如下：将HEK-293T细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度约80％时进行慢病毒包装质粒和重组慢病毒质粒的共转染实验；运用Lipofectamine 2000转染试剂将pLVX-CMV-GLuc-p30、pCMV-VSV-G、psPAX2共转染HEK-293T细胞包装慢病毒；转染后48小时，收集细胞培养上清，即获得表达GLuc-p30抗原的慢病毒溶液，冻存于-80℃；将包装好的慢病毒颗粒转导HEK-293T细胞后，在细胞培养基中加入嘌呤霉素筛选稳定表达GLuc-p30的细胞株，培育细胞株收集培养上清，即获得融合抗原GLuc-p30。

5.一种非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：包括包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板、荧光素酶、融合抗原GLuc-p30、非洲猪瘟抗体阳性的血清标准品、非洲猪瘟抗体阴性血清标准品、荧光素酶底物、洗涤液；

其中融合抗原GLuc-p30通过权利要求2所述的方法制备得到。

6.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板通过如下步骤制备得到：

步骤一：用金黄色葡萄球菌A蛋白包被酶标反应板；

步骤二：用洗涤液清洗步骤一的酶标反应板内未结合的金黄色葡萄球菌A蛋白；

步骤三：用封闭液封闭步骤二中清洗后的酶标反应板；

步骤四：用洗涤液清洗步骤三中封闭好的酶标反应板内的残余封闭液。

7.根据权利要求6所述的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述步骤一中金黄色葡萄球菌A蛋白包被酶标反应板时，包被酶标反应板的金黄色葡萄球菌A蛋白浓度为2μg/ml；使用的包被液为无菌的磷酸盐缓冲液，pH＝7.2；包被温度为4℃，包被时间为13h。

8.根据权利要求6所述的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：步骤三中所述封闭液为含10％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，封闭条件为常温封闭1h。

9.利用权利要求5-8任一项所述的试剂盒在非洲猪瘟抗体检测中的非诊断目的检测方法，其特征在于：所述方法如下：

步骤(1)：将待检测的猪血清样品的稀释液和含有融合抗原GLuc-p30的细胞培养上清加入到包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板内孵育；

步骤(2)：用洗涤液清洗步骤(1)中的酶标反应板内未结合的融合抗原GLuc-p30以及血清残留；

步骤(3)：在步骤(2)清洗后的酶标反应板内加入荧光素酶底物溶液；

步骤(4)：将步骤(3)中的酶标反应板放入酶标仪中检测；

步骤(5)：检测结果判定标准：S/N≥71.58，判定为阳性；S/N71.58，判定为阴性。

10.根据权利要求9所述的试剂盒在非洲猪瘟抗体检测中的非诊断目的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中血清稀释度为1：100；所述融合抗原GLuc-p30加入量为1×10⁷光子计数；所述孵育条件为37℃，1h。