[发明专利]靶向人源PI3Kβ第962位酪氨酸磷酸化的兔多克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及靶向人源PI3Kβ第962位酪氨酸磷酸化的兔多克隆抗体及其制备方法与应用。本发明首先在PTEN敲除的细胞中通过磷酸化质谱结合系列分子生物学实验鉴定到PI3Kβ蛋白Y962位点发生磷酸化修饰且该位点磷酸化修饰显著影响PI3Kβ蛋白功能，故合成包含Y962位点磷酸化的抗原肽，偶连载体蛋白孔血蓝蛋白得到免疫抗原，联合佐剂六次免疫日本大耳白兔，获取纯化并鉴定PI3KβY962位点特异性磷酸化抗体。本发明能特异性检测细胞、组织样本中PI3KβY962位点磷酸化水平，为研究PI3Kβ磷酸化在肿瘤的作用与机制提供重要工具。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种靶向人源PI3Kβ第962位酪氨酸磷酸化的兔多克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

I型PI3K信号通路是最重要的细胞信号转导通路之一，PI3K磷酸化PIP2至PIP3，激活下游AKT的磷酸化，调控细胞生存、增殖、分化、凋亡、代谢等一系列重要生命活动。PI3K-AKT信号通路在多种肿瘤中异常激活。I型PI3K又分为4个亚型：PI3Kα、PI3Kβ、PI3Kγ、PI3Kδ。其中PI3Kα(PIK3CA基因)和PI3Kβ(PIK3CB基因)在多种细胞中广泛表达，两者虽有相似的结构并都具备激活AKT的能力，但两个亚型还有重要潜在不同的功能。2019年FDA批准了第一个PI3Kα抑制剂(也是第一个PI3K抑制剂药物)用于ER阳性的晚期转移的乳腺癌临床治疗。但是，抑癌基因PTEN的缺失出现了临床上肿瘤对PI3Kα抑制剂的耐药情况，因为PTEN缺失诱导肿瘤细胞从依赖PI3Kα亚型转变成依赖PI3Kβ亚型，从而导致肿瘤对PI3Kα抑制剂耐药，而且分子机制至今是个谜题。深入研究PTEN对PI3K-p110β的分子调控机制，挖掘PTEN缺失肿瘤的PI3K-p110β新靶点，对多种PTEN缺失的肿瘤治疗和PTEN缺失细胞的癌变预防都有重要意义。

蛋白质翻译后修饰是影响蛋白质间相互结合的重要机制。近年研究发现，PTEN除了经典的脂质磷酸酶活性还具有蛋白磷酸酶活性。但PTEN作为磷酸酶，其去磷酸化修饰的蛋白质底物及在肿瘤中的功能尚不清楚。

发明内容

基于以上研究进展和现状，本发明提供靶向人源PI3Kβ第962位酪氨酸磷酸化的兔多克隆抗体及其制备方法与应用。

本发明使用磷酸化修饰肽段偶连钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)免疫日本大耳白兔，获得抗PI3Kβ第962位酪氨酸磷酸化位点的多克隆抗体，可以特异性检测细胞、组织中内源性PI3Kβ第962位点的磷酸化水平，进而成为崭新的判断PTEN缺失肿瘤的标志物，为后续通过化合物库高通量筛选特异性靶向PI3Kβ第962磷酸化位点的小分子化合物提供必要的检测手段，从而有潜力成为治疗PTEN缺失肿瘤的新策略。是一种具有靶向PI3Kβ全新的磷酸化修饰位点和潜在应用于肿瘤标志物检测的高特异性多克隆抗体。

本发明所述PI3Kβ第962位酪氨酸磷酸化的兔多克隆抗体具有与PI3Kβ第962位点磷酸化特异性结合活性。本申请发明人发现PI3Kβ是PTEN新的去磷酸化修饰蛋白底物。在PTEN正常细胞中检测不到PI3Kβ磷酸化修饰，但PTEN缺失细胞中的PI3Kβ蛋白检测出2个位点(T930，Y962)的高峰度磷酸化肽段。其中，PI3KβY962位点的磷酸化能显著改变PI3Kβ与跨膜激酶的相互结合调控下游癌蛋白cMyc的表达从而驱动PTEN缺失的肿瘤发生与进展。进一步探索发现，PTEN正常时，PI3KβY962位点磷酸化水平低，主要依赖于PI3Kα；当PTEN缺失后，PI3KβY962位点磷酸化显著上调，通过上调c-Myc蛋白水平促进肿瘤的发生发展。这些结果验证PI3Kβ是PTEN新的去磷酸化修饰底物蛋白，且Y962位点是PI3Kβ影响肿瘤发生发展的关键磷酸化位点。