[发明专利]一种高产乳清酸的酵母菌株及其应用

说明书

本发明提供一种能过量合成胞外乳清酸的酵母菌株及其构建方法、发酵工艺与在医药、美容、畜牧业、食品、保健品或化工领域中的应用。所述酵母菌株包括第一种和第二种基因修饰，其中，所述第一种基因是乳清酸核苷‑5'‑磷酸脱羧酶编码基因URA3，通过修饰第一种基因使乳清酸核苷‑5'‑磷酸脱羧酶活性下降或表达被抑制；第二种基因包括嘧啶合成途径其它基因、组氨酸合成途径相关基因和/或嘌呤合成途径相关基因，第二种基因修饰使得嘧啶合成途径其它基因编码酶蛋白的活性提高或者过表达，或者组氨酸合成途径和/或嘌呤合成途径相关酶蛋白的活性下降或表达被抑制。所述酵母的乳清酸产量大幅上升，其中，所述乳清酸产量上升，是相对于未经基因修饰和经过第一种基因修饰的酵母的乳清酸产量而言。

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种能过量合成乳清酸的酵母菌株及其构建方法、发酵工艺与在医药、美容、畜牧业、食品、保健品或化工领域中的应用。

背景技术

乳清酸(Orotate,orotic Acid)，化学名称尿嘧啶-6-羧酸，分子式C₅H₅N₂O₄，分子量156.10。作为生物活体嘧啶基核酸生物合成过程中的有效前体，是一种重要的嘧啶衍生物，在生物和药物化学中发挥独特的作用。乳清酸是一种营养药，又名维生素B13，乳清酸盐类，例如乳清酸钙、乳清酸镁和乳清酸锂，都是很好的营养品。乳清酸在医药、食品、保健品、化妆品和饲料行业等领域应用非常广泛，现年需求量在500吨以上。

目前乳清酸以化学生产为主，随着中国对环保要求的日益严格，化学合成乳清酸的成本也相应的提高，环保和低成本的生物制造乳清酸的方式就显得非常重要了。目前报道的生物法主要是微生物发酵法，微生物发酵法生产条件温和、工艺简单、能利用廉价的碳源，副产物少、环境污染小，可实现持续生产等等，是有潜力的、值得大力开发的工艺。

通过对自然界微生物菌种进行基因工程改造，结合诱变筛选等措施来提高乳清酸产量。这些菌种包括谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等；遗憾的是，迄今为止还没有酵母生产乳清酸的报道。

而作为最重要、拥有最高商业产值的工业微生物，酿酒酵母应用历史悠久，工业化应用技术成熟、抗逆性强、为食品安全性GRAS微生物；同时作为最早实现全基因组测序的微生物菌种，又是分子生物学和遗传学研究的最重要模式生物之一，通过基因工程手段的改造实现以酿酒酵母为菌种的乳清酸发酵法生产，有其特殊的优势，将为微生物发酵生产乳清酸开辟新的途径，推动高值医药和生化产品的绿色清洁生产，具有重要的经济价值和社会意义。

发明内容

本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供一种容易培养、适合大规模发酵生产并易于实现产业化的、经过遗传改造而能过量合成乳清酸的酵母菌株，构建此菌株的重组方法及应用。具体地，

本发明提供一种酵母菌株，此酵母菌株经过了第一种、第二种基因修饰。其中，所述第一种基因是URA3，它编码的酶蛋白为乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶(orotidine-5'-phosphate decarboxylase)，所述酶蛋白催化从头合成嘧啶途径的第6个酶催化反应，将乳清酸核苷-5'-磷酸转化为尿苷一磷酸(uridine monophosphate，简称为UMP)；通过修饰第一种基因使其活性下降或表达被抑制，使得乳清酸核苷-5'-磷酸不能转变为尿苷一磷酸(uridine monophosphate，简称为UMP)，从而有可能积累作为从头合成嘧啶途径第4个酶催化反应产物的乳清酸。但，仅仅此步催化中断还不足以使得酵母细胞积累足量的乳清酸；

所述第二种基因包括嘧啶合成途径其它基因、组氨酸合成途径相关基因和/或嘌呤合成途径相关基因，所述第二种基因修饰使得嘧啶合成途径其它基因编码酶蛋白的活性提高或者过表达，或者组氨酸合成途径和/或嘌呤合成途径相关酶蛋白的活性下降或表达被抑制，所述酵母菌株的乳清酸产量上升，其中，所述乳清酸产量上升，是相对于未经基因修饰的，和/或只经过第一种基因修饰的酵母的乳清酸产量而言。