[发明专利]东莨菪内酯的酶法制备方法

说明书

本发明涉及一种东莨菪内酯的酶法制备方法，具体包括先制备含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌；再将重组基因工程菌活化、发酵后，以阿魏酸为底物再发酵培养转化得东莨菪内酯。经基因序列优化后，本发明首次将阿魏酰辅酶A合成酶和F6’H1酶同时构建在大肠杆菌中且实现二者同时高效的功能性共表达。建立了以价格低廉、安全低毒可持续的阿魏酸为底物，通过“两个酶‑两步催化‑一锅合成”的方式快速高效便捷合成具有高附加值的产物东莨菪内酯。本发明以1mM阿魏酸为底物催化12h后，生产摩尔产率达到86.5％，获得以阿魏酸为底物生产东莨菪内酯最高产量166.28mg/L，催化过程简单、环保，具有广阔的工业化应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及东莨菪内酯的酶法制备方法。

背景技术

东莨菪内酯，又称东莨菪素、莨菪酚、莨菪亭，化学名为7-羟基-6甲氧基香豆素，英文名为：scopoletin，属于香豆素类化合物中的一种，分子式为C₁₀H₈O₄，相对分子质量为192.17，是植物体内一种重要的酚类抗毒素。东莨菪内酯广泛存在于多种药用植物、杂草和作物中，目前发现含有东莨菪内酯的植物超过110000种。东莨菪内酯已证实具有多种生物活性，临床上具有抗癌、抗炎、保肝、解痉挛的作用，同时也有研究表明东莨菪内酯可以通过降血压、调节血脂抑制主动脉收缩从而抗心血管疾病，对老年痴呆症也具有很好的治疗作用，还具有抗血小板凝聚、抗HIV和抗氧化等活性。

随着东莨菪内酯的活性不断被挖掘，市场的需求日益增大，东莨菪内酯的生产问题成为了研究的热点。然而，目前东莨菪内酯的获取主要通过从中药植物黄花蒿的组织中进行分离提取。然而东莨菪内酯在植物中的含量非常低下，传统的获取方式在提倡环境友好型社会发展的当下有着诸多的弊端。其次，植物中的多种东莨菪内酯类似物难以通过低成本和无公害的方式进行去除。化学合成现今面临反应时间长，高耗能、毒副产品及环境污染等难题未能解决。合成生物学的发展为诸多植物次生代谢产物的合成提供了可能。它主要是利用重组微生物工程菌株的发酵来实现，微生物菌株能简便地从实验室到工业化的大规模生产，且具有生产周期短、培养成本低、产物提纯简便和环境污染少等优势，相比起来，具有更广阔的应用前景。

近年来，利用基因工程技术改造大肠杆菌，使其生物合成东莨菪内酯的研究报道很少。Lin等^[1]在大肠杆菌中共表达酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonia-lyase，TAL)、大肠杆菌羟化酶(two-component flavin-dependent monoxygenase，HpaBC)、咖啡酰-CoA-O-甲基转移酶(Caffeoyl-CoA-3-O-methyltransferase，CcoOMT)、4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)和阿魏酰-CoA-6’-羟化酶(Feruloyl-CoA hydroxylase，F6’H)，实现了以葡萄糖和甘油为碳源生成31mg/L东莨菪内酯。Yang等^[2]将F6’H与GST标签蛋白融合后，增强了F6’H的稳定性和溶解性，以阿魏酸为底物生成了80mg/L东莨菪内酯。由此可以看出，微生物制备东莨菪内酯仍处于起步阶段，有许多问题有待解决，能完善和优化出一套东莨菪内酯合成制备体系，定将对东莨菪内酯的产业有重要的推动作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成效率高的东莨菪内酯的酶法制备方法。该方法可高产东莨菪内酯，催化过程简单、环保，具有广阔的工业化应用前景。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、东莨菪内酯的酶法制备方法，包括以下步骤：

A.制备含有F6’H1基因和阿魏酰辅酶A合成酶基因的重组基因工程菌；

B.将重组基因工程菌活化、发酵后，以阿魏酸为底物再发酵培养转化得东莨菪内酯。