[发明专利]一种醋酸加尼瑞克的纯化方法

说明书

本发明属于纯化方法技术领域，公开了一种醋酸加尼瑞克的纯化方法。本发明通过一步反相层析完成了醋酸加尼瑞克粗肽的纯化，再经过转盐、旋蒸、冻干获得了纯度≥99.9％，最大单杂含量≤0.05％，乙酸根含量为7.10‑10.80％，TFA离子含量＜0.05％，氯离子含量＜0.05％、硫酸根含量＜0.02％和磷酸根含量＜0.05％的醋酸加尼瑞克精肽样品。在反相层析中采用乙酸盐‑TFA缓冲液，弥补了离子配对剂本身没有缓冲能力的缺点，解决了离子配对剂体系重现性差的问题，使制备峰形稳定，提高了杂质去除能力。且纯化、转盐流动相体系中均使用到乙酸盐和乙酸，使用物料单一，减少了其他离子的引入，缩短了转盐工艺的周期，有利于工业化的放大生产。

技术领域

本发明涉及一种多肽的纯化方法，具体涉及一种醋酸加尼瑞克的纯化方式，属于生物医药技术领域。

背景技术

由过早出现促黄体激素峰引起的生育障碍在全世界的发病率达9％，所以在女性接收辅助生殖技术控制性卵巢刺激方案中使用促性腺激素释放激素GnRH拮抗剂已成为主要的临床治疗手段。

醋酸加尼瑞克注射液是由默沙东公司研发、生产，于2013年经中国国家食品药品监督管理局批准在中国上市，其活性成分为醋酸加尼瑞克。醋酸加尼瑞克是一种人工合成的十肽化合物，通过对内源性的GnRH第1、2、3、6、8、10位点的氨基酸置换而得，其氨基酸序列为：Ac-D-Nal-D-Cpa-D-Pal-Ser-Tyr-D-HArg(Et₂)-Leu-HArg(Et₂)-Pro-D-Ala-NH₂。由于醋酸加尼瑞克对内源性的GnRH具有较高的拮抗作用，所以能够竞争性结合在促性腺激素的GnRH受体上，快速、可逆地抑制体内促卵泡激素(FSH)和促黄体激素(LH)的释放。加上醋酸加尼瑞克具有不良反应少、妊娠率高、治疗周期短等特点，使其在临床上比同类药物占据更大的优势和市场。

在多肽合成的过程中容易产生较多的杂质，如副反应杂质、同分异构体杂质、消旋杂质、氨基酸缺失或增加杂质，所以合成后的醋酸加尼瑞克粗肽的纯化主要通过分辨率更高的反相层析法。在专利CN 104371010B中以反相C18填料为固定相，以0.1％TFA/水溶液为流动相A，0.1％TFA/乙腈水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，再将洗脱液进行转盐冻干得到纯度大于99.7％，已知最大单杂最高为0.09％，未知最大单杂小于0.1％的醋酸加尼瑞克纯品，总收率为65.7％。在专利CN 102993274B中以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以一定浓度的高氯酸钠/磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，再将洗脱液进行转盐冻干得到纯度为99.73％，单个杂质均小于0.1％的醋酸加尼瑞克纯品，纯化收率为91.1％。该方法虽然纯化效果好，收率高，但不利于工业生产，在纯化流动相中需要用到高氯酸钠。高氯酸钠是一种易制爆危险化学品，与有机物摩擦或撞击或接触浓硫酸都能引起爆炸，在工业化放大生产中需要用到大量高氯酸钠，会有很大的安全隐患。且用高氯酸钠溶液作为纯化流动相会引入许多其他离子，为后续的转盐、检测也带来较大困难，因此在实际的工业化生产中还是存在一定问题。

基于现有技术存在的问题，在保证醋酸加尼瑞克纯度和收率的前提下，使纯化工艺利于放大生产，是本发明需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种醋酸加尼瑞克的纯化方法。在本发明中，对醋酸加尼瑞克粗肽采用一步反相层析法进行纯化，再经过转盐、旋蒸、冻干得到纯度≥99.9％，最大单杂含量≤0.05％的醋酸加尼瑞克精肽。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一种醋酸加尼瑞克的纯化方法，其包括以下步骤：

1)纯化：以含乙酸盐和离子配对剂的酸性缓冲液和有机溶剂为纯化流动相(RP1-A和RP1-B)，以反相填料为固定相；

2)转盐：以含乙酸盐的缓冲液和有机溶剂为转盐流动相(RP2-A2)，以反相填料为固定相。