[发明专利]一种短糖链修饰的IsPETase及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种短糖链修饰的IsPETase及其制备方法和应用，其制备方法具体为：先构建IsPETase多拷贝串联表达载体，再将IsPETase多拷贝表达载体转化宿主细胞，发酵后收集上清，其中所述宿主细胞为真核生物细胞，采用滤膜过滤上清，然后加入Endo H进行反应即得。本发明所得的重组IsPETase具有短糖链修饰且具备高热稳定性和高活性，而且该制备方法通过基因剂量效应和高密度表达能有效提高产量，适用于工业化生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种短糖链修饰的IsPETase(来源于Ideonellasakaiensis的PET塑料降解酶)以及其制备方法和在PET(Polyehyleneterephthalate)塑料的生物降解中的应用。

背景技术

由于石油化学产品的低成本及塑料的广泛使用，塑料的生产量大幅增加。其中只有一小部分被回收利用，大部分被掩埋进土壤或焚烧。因合成塑料难以被生物降解，排放到环境中的塑料废弃物会在自然界中积累，对环境产生有害影响。如土壤中的塑料堆积会造成土壤板结，使土壤通透性降低；水体中的微塑料更是会进入水生食物链，最终影响人类的身体健康。因此如何通过绿色环保的方式处理塑料废弃物一直是世界难题。

通过生物降解法使得塑料废弃物中的高分子聚物分解成低聚物或者单体的方法相对环保，不会造成二次污染。其中，PET塑料的生物降解已经取得了令人瞩目的进展。2016年，日本科学家从一家PET回收工厂分离出一株利用PET塑料作为主要碳源的细菌Ideonellasakaiensis 201-F6，并从中鉴定了一个PET塑料酶，名为IsPETase，该酶可在常温下将PET降解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(MHET)、对苯二甲酸(TPA)和乙二醇。但是IsPETase的热稳定性差，反应温度低，严重的削弱了它在实际应用中的效果。因此，多个实验室采用机器学习和理性设计的方法对IsPETase进行了改造并获得了热稳定性显著提高的PET降解酶，如Thermo-PETase，FAST-PETase等。但是如何大规模，低成本制备IsPETase及其突变体，从而应用于工业化生产还未见报道。

前期有报道(General features to enhance enzymatic activity of poly(ethylene terephthalate)hydrolysis，Nature Catalysis,4:425-430,2021)成功采用毕赤酵母重组表达系统进行了IsPETase的分泌表达，并发现用EndoH去糖基化后的重组IsPETase具有比大肠杆菌重组表达的IsPETase更高的比活性。但是该报道中使用的是单拷贝表达质粒，目的基因表达水平较低，并且采用商品化的EndoH进行去糖基化，价格昂贵，不具备工业应用价值。

发明内容

针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种制备重组IsPETase的方法，所得重组IsPETase具有短糖链修饰且具备高热稳定性，而且该制备方法通过基因剂量效应和高密度表达能有效提高产量，适用于工业化生产。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

本发明首先提供了一种制备短糖链修饰IsPETase的方法，包括如下步骤：

步骤一、构建IsPETase多拷贝串联表达载体；

步骤二、将IsPETase多拷贝表达载体转染宿主细胞，发酵后收集上清；其中所述宿主细胞为真核生物细胞；

步骤三、采用滤膜过滤上清，然后加入Endo H进行反应。

进一步地，在上述技术方案中，IsPETase多拷贝串联表达载体中的IsPETase基因拷贝数为2～4。