[发明专利]用于提取核酸的细胞裂解液及其应用

说明书

本发明涉及用于提取核酸的细胞裂解液及其应用。本发明的细胞裂解液包括：5‑20mM NaOH；1‑10％(w/v)Chelex‑100；0.05‑0.5％(v/v)NP40；和0.05‑5mM EDTA。本发明的细胞裂解液用于提取核酸快速简单，减少了核酸损失以及减少样品交叉污染的可能性，成本低且适用于微量细胞样品的DNA制备。

技术领域

本发明涉及一种用于提取核酸的细胞裂解液及其应用。

背景技术

基因编辑后获得的细胞需要快速抽提DNA用于基因型鉴定以确定基因打靶成功的细胞株。获取DNA的传统方法是以新鲜、-70℃或液氮保存的标本为材料，通过蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，结合离心柱法或磁珠法进行核酸提取。1987年，Fey等首先用NP40成功地从骨髓涂片中提取到较高分子量的DNA，用于Southern印迹分析，但这种方法均需蛋白酶K消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀等步骤，操作复杂，费时且需要的样品量较多。同时，需要在多个离心管之间转移，易造成核酸的损失及标本间的交叉污染。由于PCR技术对DNA样品的纯度和分子量的要求相对较低，对微量的DNA即可扩增，部分降解的DNA也可作PCR检测。因此，用NP40和蛋白酶K消化的粗提产物也可用于PCR。后来人们发现用HOTSHOT DNA消化法用于小鼠尾巴或耳样的DNA抽提可以更简洁有效的进行PCR鉴定。近年来，Chelex-100被广泛用于检材较少或只需少量DNA的检测。Chelex-100是一种化学整合树脂，有苯乙烯，二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合二价金属离子，抑制DNA酶而达到减少DNA降解的目的。Chelex-100结合蛋白酶K消化法被广泛用于法医学，肿瘤学鉴定及分子生物学实验。对基因编辑胚胎干细胞进行鉴定有时只能获得数10个细胞用于鉴定，而且蛋白酶K消化要花费较长的时间，需要更快更灵敏的从基因编辑胚胎干细胞进行DNA抽提。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明开发了Chelex-100与HOTSHOT结合的核酸提取法，提供了一种细胞裂解液，以及基于该裂解液的核酸提取方法和采用基于该裂解液的细胞裂解物直接进行PCR的方法。本发明提供的细胞裂解液中，通过化学原理可迅速破坏细胞膜结构，达到裂解细胞释放核酸的目的，同时通过抑制DNA酶活性，减少DNA降解，而减少中转管的使用，避免液体在离心管间移动和移液器吸头移液导致的微量核酸损失，进一步提高核酸提取效率。

为此，在第一方面，本发明一种用于提取核酸的细胞裂解液，包括：

在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，NaOH的浓度可以为5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM、20mM或它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，Chelex-100的浓度为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)、9％(w/v)、10％(w/v)或它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，NP40的浓度为0.05％(v/v)、0.1％(v/v)、0.15％(v/v)、0.2％(v/v)、0.25％(v/v)、0.3％(v/v)、0.35％(v/v)、0.4％(v/v)、0.45％(v/v)、0.5％(v/v)或它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，EDTA的浓度为0.05mM、0.1mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM或它们之间的任意值。

在一些实施方式中，所述细胞裂解液包括：

在一些实施方式中，包括10mM NaOH、5％(w/v)Chelex-100、0.1％(v/v)NP40和0.1mM EDTA。