[发明专利]Art v 1重组蛋白及其应用

说明书

本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体涉及Art v 1重组蛋白及其应用。本发明成功构建了致敏蛋白Art v 1高表达的原核体外表达体系。本发明对Art v 1基因的序列进行了优化，得到适用于原核表达系统的编码Art v 1重组蛋白的核酸分子；并将所述核酸分子经人工合成后亚克隆至真核载体得到重组载体，转化原核表达系统，实现了Art v 1重组蛋白的高效表达，优化后200ml OD₆₀₀为0.6的大肠杆菌约能纯化500μg蛋白；本发明的制备方法操作简单、成本低、产量大、活性高，在过敏性疾病诊断和治疗领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及蛋白表达技术领域，具体涉及Art v 1重组蛋白及其应用。

背景技术

变应性鼻炎是指鼻黏膜暴露于变应原后发生的非感染性慢性炎性反应。流行病学调查表明，在过去的几十年中AR的发病率逐渐增加，目前影响全世界人口的10％～40％。变应性鼻炎不仅影响生活质量，也可造成巨大的社会经济负担，已经成为全球性健康问题，但其发病机理尚不明确。主要的变应原分为两类，季节性变应原主要包含花粉和霉菌，常年性变应原主要包含尘螨、宠物、害虫和一些霉菌。花粉是季节性变应性鼻炎的主要变应原。由于地理条件、气候因素和人为因素，植物的分布存在明显地域性，因此造成了花粉播散的区域性特征，如蒿草是我国北方地区夏秋季节最常见的变应原。Art v 1是蒿草花粉的主要致敏蛋白，是一种模块化糖蛋白，具有类似防御素的结构域和富含羟脯氨酸的结构域。因此，通过Art v 1重组蛋白的体外制备是研究蒿草花粉导致的季节性变应性鼻炎发病机制是一种重要手段。

目前针对蒿草花粉在变应性鼻炎中的探究主要使用蒿草的冻干粉或粗提物，使用无菌PBS缓冲液溶解后的冻干粉或粗提物处理细胞或用于动物实验，探究蒿草变应原在变应性鼻炎中的致病机理，但其缺点是不同批次的冻干粉或粗提物存在差异，其中主要致敏蛋白的含量不同，实验可重复性较差。且冻干粉和粗提物是一种复杂的复合成分，在致病机制的探究中无法阐明具体是那种蛋白或成分发挥的致病作用。个别研究中也有人使用Artv 1的天然提取物，该天然蛋白使用液相色谱或质谱等手段从蒿草中分离提取，具有价格昂贵，提取量低等缺点。

随着分子生物学技术的发展，利用基因工程重组变应原用于变应性疾病成为研究热点之一。重组变应原即从编码变应原的cDNA开始，通过重组DNA技术，得到大量高度纯化的变应原，这些变应原具有良好的批间一致性，能够满足医学上对变应原的质量要求。目前已有研究人员将来自于蒿草的Art v 1蛋白克隆于pcDNA3.1/myc-His A载体，以哺乳细胞HEK293F细胞为宿主进行了表达，表达蛋白纯度较高。但与以微生物为宿主进行比较，哺乳动物细胞复制再生能力弱，培养条件要求高，扩大生产难度大等特点进一步限制了该蛋白的表达，且由于该蛋白原核异源表达容易产生包涵体，增加了蛋白纯化难度，所以目前还没有该蛋白在原核模式生物中进行表达的案例出现。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供Art v 1重组蛋白及其应用。

本发明提供了一种编码Art v 1的核酸，包括如下I)～IV中的任意一种：

I)、序列如SEQ ID NO.2所示的核酸；

II)、与如I)所示的核酸具有至少80％同源性且与I)所述核酸编码相同或相似功能的蛋白；

II)、如I)所示的核酸经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基的核酸；

IV)、与如I)所示的核酸互补或部分互补的核酸。

进一步的，本发明所述的Art v 1来源于蒿草，其原始核酸序列如SEQ ID NO.1所示，在充分考虑了密码子使用频率和RNA酶的剪接位点、RNA稳定反式作用元件后进行了优化，优化后的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明经实验表明，优化序列编码的Art v 1蛋白表达量高、溶解性大、蛋白活性强。