[发明专利]死亡素和斑点叉尾鮰β-防御素基因重组毕赤酵母的构建方法及应用

说明书

本发明公开了死亡素和斑点叉尾鮰β‑防御素基因重组毕赤酵母的构建及抗菌活性研究。试验将死亡素和防御素经酵母偏好密码子优化后构建共表达TD基因至载体pPICZαA上，PCR、双酶切和测序筛选后经Sac I线性化，电转化至酵母表达菌株GS115中，Zeocin抗性、PCR筛选获得重组高抗阳性转化工程菌株GS115‑pPICZαA‑TD（Mut+），用0.5%甲醇诱导目的蛋白的表达，96 h后收集培养基上清冻干浓缩并纯化，进行体外抑菌试验、溶血性试验及细胞毒性试验。结果表明，本试验成功获得重组毕赤酵母且表达出广谱高效抑菌、安全性高的重组抗菌蛋白，为临床预防和治疗细菌性疾病提供治疗思路和实验依据。

技术领域

本发明涉及构建表达菌株的方法，具体说，是一种共表达死亡素thanatin和斑点叉尾鮰β-防御素基因defbl重组毕赤酵母的构建方法及抗菌蛋白活性研究。

背景技术

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）广泛存在于各种生物中，是生物天然免疫系统中重要的免疫活性分子，具有分子量小、稳定性好、广谱抗菌、抗肿瘤、抗病毒的特点，同时也可抑制某些真菌和寄生虫，表现出对耐抗生素菌株很强的抑制性，耐酸、耐碱、耐高温、易降解、不易使细菌等产生耐药性，在医药、食品、畜牧行业上有着良好的应用前景，“抗菌肽替抗”已成为一种可行方案。

死亡素thanatin是从刺肩蝽（Podisus maciventris）血液淋巴中分离出来的有21个氨基酸的小分子抗菌肽，1996年就被报道其具有广谱抗菌作用，生理浓度下就具有广泛抑菌作用，同时抑制某些原虫和真菌，但对金黄色葡萄球菌抗性较低；斑点叉尾鮰的β-防御素是其免疫系统中的一个重要因子，已有研究表明其水溶液能抑制多种细菌生长，反向平行的二硫键结构使其结构稳定，不易被蛋白酶等水解，可发挥长效抑菌作用。

目前，随着相关分子生物学技术的发展，利用细菌、真菌、细胞等外源表达出高抗菌活性、不易产生耐药性且安全性高的抗菌肽类药物来代替常规抗生素的使用，已成研究热点，本研究将死亡素thanatin基因和斑点叉尾鮰β-防御素基因defbl用T2A连接，构建重组毕赤酵母，以期通过单次诱导即可同时表达两种抗菌肽，既实现了协同抗菌作用，又可共同进行纯化操作，简便操作环节，为预防和治疗细菌性疾病、研发新型广谱抑菌药物提供理论和试验依据。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种共表达死亡素thanatin基因和和斑点叉尾鮰β-防御素基因defbl的重组毕赤酵母菌株，命名为：GS115-pPICZαA-TD。

本发明进一步公开了所述共表达死亡素thanatin基因和斑点叉尾鮰β-防御素基因defbl重组毕赤酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）根据死亡素thanatin蛋白序列（APD ID: AP00102），经毕赤酵母偏好性密码子进行优化得到thanatin基因序列SEQ ID NO.7；根据斑点叉尾鮰β-防御素基因（GenBankID: KX211992.1），经毕赤酵母偏好性密码子进行优化得到defbl基因序列SEQ ID NO.8；经T2A连接的thanatin和defbl基因序列得到共表达TD基因序列SEQ ID NO.9；

2）所述的thanatin基因、defbl基因和TD基因的PCR扩增包括：以thanatin-F SEQID NO.1和thanatin-R SEQ ID NO.2为引物，扩增thanatin基因；以defbl-F SEQ ID NO.3和defbl-R SEQ ID NO.4为引物扩增defbl基因；以TD-F SEQ ID NO.5和TD-R SEQ ID NO.6为引物扩增TD基因；

3）将获得的目的基因克隆至pPICZαA载体，经Sac I线性化后电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞内，构建了包含上述基因的重组毕赤酵母表达菌株GS115-pPICZαA-thanatin、GS115-pPICZαA-defbl、GS115-pPICZαA-TD。