[发明专利]产气荚膜梭菌α毒素抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌α毒素抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法。试剂盒至少包括试纸条，试纸条由加样端开始依次设有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；结合垫上喷涂有偶联产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白的荧光微球；硝酸纤维素膜靠近吸水垫一侧设有质控线，质控线喷涂有鼠源产气荚膜梭菌α毒素截短蛋白的单克隆抗体，靠近加样端一侧设有检测线，检测线喷涂有截短表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白，截短表达的产气荚膜梭菌α毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明实现了对多种动物血清中α毒素抗体检定性与定量的检测，具有广泛实用性。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种产气荚膜梭菌α毒素抗体荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

产气荚膜梭菌广泛存在于空气、水、土壤、食品及动物的胃肠道中，是自然界中常见的条件性致病菌，当动物抵抗力下降时即可引起发病，导致动物猝死症，发病急、病程短、死亡率高。近年来，产气荚膜梭菌流行情况较为严重，对羊、兔、猪、鸡、鸭、牛的危害越来越多。α毒素(CPA)是几乎所有类型产气荚膜梭菌都能产生的一种多功能性金属酶，是典型的致死性毒素，因此α毒素是评价产气荚膜梭菌病的重要依据和判定食品安全的重要指标。α毒素的抗体水平也是评价动物机体抵抗梭菌感染能力的重要指标。

目前，针对产气荚膜梭菌α毒素及抗体的常用检测方法包括微生物学方法、免疫学方法、分子生物学方法。微生物学方法为将处理后的病理样品接种到选择培养基进行分离培养，对疑菌落涂片进行革兰氏染色镜检、生化反应检查、溶血试验以及动物试验；免疫学方法一般采用毒素(血清)中和试验、酶联免疫吸附实验；分子生物学方法为聚合酶链式反应(PCR)。

常见的血清抗体检测方法有ELISA法、胶体金法。但ELISA法耗时较长，需要酶标仪及专业人员操作，鲍长磊(产气荚膜梭菌不同毒素型多重PCR和α毒素抗体ELISA检测方法的建立及初步应用[D].西北农林科技大学,2016.)建立的羊α毒素抗体间接ELISA方法，检测用时要两个半小时以上；楚国茹、王海荣等(发明专利申请CN201310196434.1)建立的用于兔产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA方法，检测用时要2小时15分钟以上；赵蕾、李广兴等(发明专利申请CN201510004352.X)建立的单抗阻断ELISA检测方法，检测用时3小时10分钟以上。胶体金法虽方便快捷但灵敏度、稳定性较差，容易产生人为误差。

荧光微球法是指将直径在纳米到微米之间的球形荧光物质通过物理和化学等方法标记在粒子的表面或包埋在微球内部，具有形状和大小相对稳定、单分散性好、发光效率高、与生物体之间相互作用后产生的各种反应好、吸附性强、比表面积大、表面反应能力强和凝集作用大等优点。微球与抗体或抗原结合后不会对其与相关抗原抗体的反应产生影响。荧光微球检测时受到环境及样品中的溶剂、热、电、磁等的影响小得多。采用较长荧光半衰期的稀土离子作标记物，由于这种标记物Stokes位移大(150nm)且荧光寿命比本底物质荧光寿命高5～6个数量级，因此，测定时只要延缓测量时间，待本底物质的荧光充分衰减后再测定标记物的信号就可有效地消除各种非特异性荧光的干扰，获得很高的灵敏度。同时荧光微球表面修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高了标记物的稳定性。将时间分辨荧光微球代替代胶体金作为示踪物，其灵敏度高于普通胶体金或有色乳胶免疫层析方法1～3个数量级。

发明内容

针对ELISA法耗时较长，胶体金法灵敏度、稳定性较差的技术问题，本发明提供一种产气荚膜梭菌α毒素荧光微球免疫层析检测试剂盒及其制备方法，通过使用双抗原夹心法检测及特异性单抗做质控线，同时搭配使用荧光微球，实现了对多种动物(羊、兔、猪、鸡、鸭、牛)血清中α毒素抗体的检测，具有广泛实用性，较传统的ELISA方法具有方便快捷的特点，不需要专业人员及贵重的仪器设备，较胶体金的方法具有更高的稳定性与可靠性。