[发明专利]一种具有宽底物谱的将羧酸专一转化为手性β-羟基羧酸的人工酶有效
| 申请号： | 202210491196.3 | 申请日： | 2022-05-07 |
| 公开（公告）号： | CN114921427B | 公开（公告）日： | 2023-08-01 |
| 发明（设计）人： | 王喜庆;张腾飞;章昆 | 申请（专利权）人： | 扬州大学 |
| 主分类号： | C12N9/02 | 分类号： | C12N9/02;C12N15/53;C12N15/10;C12P7/42;C12P17/04;C12P17/12;C12P7/6409;C12P7/6427 |
| 代理公司： | 南京纵横知识产权代理有限公司 32224 | 代理人： | 董建林 |
| 地址： | 225009 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 具有 宽底物谱 羧酸 专一 转化 手性 羟基 人工 | ||
1. 一种羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体，其特征在于，所述羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2. 一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1所述羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3. 如权利要求1所述羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的制备方法，其特征在于，将野生型的P450BSβ第78位的亮氨酸突变成异亮氨酸，将第85位的谷氨酰胺突变组氨酸，将第290位的甘氨酸突变成异亮氨酸，所述野生型的P450BSβ序列如SEQ ID NO:3所示。
4.如权利要求1所述羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
构建表达野生型羧酸羟基化酶P450BSβ的质粒，并将该质粒转化到大肠杆菌中；
通过三轮定点饱和突变，构建饱和突变库，筛选到表达能够高度区域选择性和对映体选择性氧化羧酸β位C-H基团的P450BSβ突变体的突变质粒；
羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的表达及纯化。
5.根据权利要求4所述的羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的制备方法，其特征在于，羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体的表达及纯化包括如下步骤：
将筛选到的突变质粒在LB液体培养基中过夜培养，加入TB液体培养基扩培，于对数生长期内加入血红素前体δ-氨基乙酰丙酸和IPTG诱导表达后，离心收菌；
用缓冲液将得到的菌体重悬，通过超声破碎裂解细胞，离心，获得上清液；
将上清液加入镍离子亲和柱内，使带有His标签的目的蛋白与镍离子结合，除去杂蛋白，洗脱目的蛋白，得到羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体。
6.一种β-羟基羧酸的制备方法，其特征在于，以C6-C20链长的天然直链饱和脂肪酸、天然不饱和脂肪酸以及非天然羧酸作为底物，将过氧化氢作为氧化剂，以权利要求1所述的羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体为催化剂进行催化反应。
7.根据权利要求6所述的β-羟基羧酸的制备方法，其特征在于，所述天然不饱和脂肪酸为油酸或亚油酸；所述非天然羧酸含有烯烃、炔烃、溴、胺、腈、酯、二羟基、环戊基、呋喃、吡咯、苯甲氧基、氟苯基、氯苯基、苯甲酰甲氧基的一种或多种官能团。
8.根据权利要求6所述的β-羟基羧酸的制备方法，其特征在于，所述β-羟基羧酸为R型β-羟基羧酸。
9.根据权利要求6所述的β-羟基羧酸的制备方法，其特征在于，在室温下进行反应，反应体系为水相体系。
10.根据权利要求1所述的羧酸β-羟基化酶P450BSβ突变体在制备β-羟基羧酸的应用。
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