[发明专利]香蕉SSUII基因、克隆方法、表达载体及应用

说明书

本发明公开香蕉SSUII基因，通过提取香蕉“Musa spp.”总RNA，反转录合成cDNA，设计特异引物，利用PCR方法获得SSU‑II基因的全长cDNA，与pEASY‑Blunt载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆得到香蕉SSU‑II基因，该基因的cDNA全长为Mt21507为1309bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。利用实时荧光定量PCR测定了不同基因型香蕉SSUII基因的表达水平，证实TTT型Karat香蕉中的SSUII基因表达量确高于AAA型以及BB型香蕉。将SSUII基因连接到植物表达载体pBI121上，构建一个新的植物表达载体。该基因会影响香蕉果实的类胡萝卜素含量的积累，SSUII基因为研究香蕉高类胡萝卜素含量的分子机理和改造低类胡萝卜素香蕉，为香蕉高类胡萝卜素含量育种提供理论依据具有重要的理论及实践意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及香蕉SSUII基因的克隆、表达特性分析、表达载体构建、对香蕉类胡萝卜素合成的调控作用。

背景技术

类胡萝卜素普遍存在于所有高等植物中，因其为维生素A的前体及能够强力清除单态氧的抗氧化剂而成为人体营养和健康最必需的成分之一，被称为维生素A原。医学研究证明，类胡萝卜素在猝灭自由基、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等保护人类健康方面起着重要的作用。当人体类胡萝卜素摄取量不达标时，则会引发相应的疾病，例如维生素A缺乏症(Vitamin A deficiency，VAD)与微量营养元素缺乏(Micronutrientdeficiencies，MNDs)。世界卫生组织(WHO)估计，有25万至50万儿童因缺乏维生素A而失明，撒哈拉以南非洲和南亚是VAD的高发区。微量营养元素缺乏会造成“隐形饥饿”，导致传染病、精神障碍和视力丧失等残疾的发病率上升，甚至死亡。

香蕉(Musa spp.)，芭蕉科芭蕉属多年生大型常绿单子叶草本植物，是世界四大水果之一，也是许多发展中国家的主要粮食作物，具有很高的经济价值及营养价值，但常见香蕉品种中类胡萝卜素含量相对匮乏。不同香蕉品种类胡萝卜素含量存在差异，密克罗尼西亚联邦的研究发现，黄色和橙色果肉的香蕉品种含有最高水平的反式β-胡萝卜素。前期的研究发现，目前主要栽培的AAA 型香蕉中类胡萝卜素含量较低，但非主栽品种TTT型的Karat香蕉中，成熟香蕉的类胡萝卜素含量高达2230μg/100g，是香蕉主要栽培品种类胡萝卜素含量的100倍以上。

高等植物通常有一个短链prenyltransferase(PTS)基因家族，HeterodimericGeranylgeranyl Pyrophosphate Synthase Small Subunit(SSUII)基因属于此家族，是类胡萝卜素合成的前体基因，在类胡萝卜素合成途径中发挥作用的位置极为关键，通过影响下游类胡萝卜素合成相关基因的表达，调控类胡萝卜素合成及积累。

通过对比TTT型香蕉和AAA型香蕉的转录组发现，普通AAA型香蕉中只含有一个SSUII基因，而TTT型Karat香蕉SSUII基因有三个拷贝。同时实时荧光定量PCR结果表明，TTT型香蕉中的SSUII基因表达量明显高于AAA型及 BB型香蕉的表达量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香蕉SSUII基因香蕉SSUII基因，该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明从香蕉叶片中分离出SSUII 基因的全长cDNA，并首次鉴定出SSUII具有促进类胡萝卜素形成的功能。

本发明的另一目的在于提供一种香蕉SSUII基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)以Karat香蕉(Musa spp.)为材料，利用CTAB法提取总RNA：

(2)SSUII基因的克隆：

(2-1)利用Invitrogen公司的Superscript III Kit将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；

(2-2)设计全长cDNA扩增引物；