[发明专利]香蕉SSUII基因、克隆方法、表达载体及应用

权利要求书

1.一种香蕉SSUII基因，其特征在于：该基因序列具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种香蕉SSUII基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以Karat香蕉叶片为材料，利用CTAB法提取总RNA：

(2)SSUII基因的克隆：

(2-1)利用Invitrogen公司的Superscript III Kit将RNA反转录为cDNA，作为PCR模板备用；

(2-2)设计全长cDNA扩增引物；

(2-3)根据引物的Tm值进行PCR条件的优化后，进行PCR扩增，并将获得的产物连接到大肠杆菌，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。

3.根据权利要求2所述的香蕉SSUII基因的克隆方法，其特征在于，步骤(1)总RNA的提取具体如下：

(1-1)取1mL CTAB提取液分装到2mL离心管中，65℃预热；

(1-2)称取0.2g材料，在液氮中研磨后立即转入含有CTAB提取液的离心管中，涡旋混合，65℃温浴2～3min；

(1-3)立即加入等体积的氯仿/异戊醇24:1，涡旋混合，室温，10000rpm离心15min；

(1-4)吸取上清到一新的离心管中，重复步骤(1-3)；

(1-5)取上清到一新的离心管中，加入1/3体积的8M LiCl，4℃沉淀过夜；

(1-6)4℃，10000rpm离心30min；

(1-7)弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤；

(1-8)将沉淀溶解在65℃预热的100μl STE中，立即用氯仿/异戊醇抽提一次；

(1-9)取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-80℃沉淀30min，或-20℃沉淀2h；

(1-10)4℃，10000rpm离心20min；

(1-11)沉淀分别用75％的乙醇和无水乙醇洗涤，干燥后用20ul RNase-free水溶解。

4.根据权利要求2所述的香蕉SSUII基因的克隆方法，其特征在于，步骤(2-2)中的扩增引物包括5’端引物和3’端引物，序列分别如序列表中的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。

5.一种香蕉SSUII基因表达载体，其特征在于：利用了权利要求1所述的香蕉SSUII基因为目的基因的表达载体。

6.根据权利要求5所述的香蕉SSUII基因表达载体，其特征在于：用权利要求1所述的香蕉SSUII基因插入到植物表达载体pBI121上，构建成在35S启动子下游含有香蕉SSUII基因的高效表达载体。

7.根据权利要求6所述的香蕉SSUII基因表达载体，其特征在于：根据已测序的SSU-II基因序列，设计在5’端加上KpnI酶切位点的上游引物P1和在3’端加上XbaI酶切位点的下游引物P2，通过PCR反应扩增目的片段，回收PCR产物，经测序无误后再用KpnI和XbalI双酶切该产物和植物表达载体pBI121，并将酶切获得的含有两个酶切位点的基因和pBI121载体大片段连接获得含有SSUII基因的表达载体。

8.根据权利要求7所述的香蕉SSUII基因表达载体，其特征在于：所述上游引物P1和下游引物P2的序列分别如序列表中的SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。

9.一种权利要求1所述的香蕉SSUII基因在高类胡萝卜素香蕉分子育种技术中的应用。