[发明专利]一种对腈类化合物具有高稳定性的腈水合酶突变体

说明书

本发明公开了一种对腈类化合物具有高稳定性的腈水合酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明提供的腈水合酶突变体Str.t NHase‑βL48D在65℃的半衰期大约是43分钟，相比其他NHase酶热稳定性有显著提高。采用本发明的技术方案，对于以烟腈、丙烯腈、苯甲腈、2‑氰基吡嗪腈、异丁腈、正戊腈、肉桂腈等腈类化合物为底物的反应，其底物耐受性得到了明显的提高。

本申请是针对原申请号为：CN202011307426.3，原申请日为2020年11月20日，发明名称为一种腈水合酶突变体及其应用的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种对腈类化合物具有高稳定性的腈水合酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

腈水合酶(NHase)可用于催化3-氰基吡啶生成药用价值更高的尼克酰胺，尼克酰胺又名烟酰胺，是一种维生素，已经被广泛的用于饲料、食品、制药等行业。烟酰胺市场需求量很大，预计每年需要2000多吨，但目前我国尼克酰胺的生产水平不高，规模不大，需要大量的进口，约1000吨/年。因此，将NHase用于尼克酰胺的生产有很大潜力。但是，该反应是一个放热的过程，所以生产过程中高温会影响酶活的发挥，主要是温度高，影响酶的结构，导致酶活下降，进而导致了大量的能耗，提高了生产成本。目前工业生产中主要用玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodochrous J1催化生成烟酰胺，采用的是底物分批补料的方式，但是红球菌生长周期较长，生产效率不高，烟酰胺产量最高为162g/L，而丙烯酰胺产量最高为300g/L。目前也有通过重组菌生产烟酰胺的报道，但终产物浓度较低，只有240g/L。

腈水合酶的不稳定性还体现在对底物(腈类有机物)的耐受性差，容易使腈水合酶失活；例如在丙烯酰胺的酶法制备过程中，由于腈水合酶对底物的耐受性不高，导致终产物丙烯酰胺只能维持较低的水平，给后续的丙烯酰胺浓缩工艺带来影响。随着市场的不断拓展，酰胺类化合物的需求也日益剧增，因此如何提高腈水合酶的底物耐受性已成为研究重点。获得一株有底物耐受性好、催化效率高的腈水合酶对于酰胺类工业化生产具有重要的应用价值。

发明内容

本发明旨在提供一种稳定性、酶活都提高的腈水合酶突变体并构建可以高性能催化多种腈类底物的酶工具箱。

本发明首先提供了一种腈水合酶突变体，所述突变体为(1)-(5)任一：

(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基的第37位亮氨酸突变得到的；

(2)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第41位苯丙氨酸突变得到的；

(3)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位酪氨酸突变得到的；

(4)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第48位亮氨酸突变得到的；

(5)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第51位苯丙氨酸突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为(1)-(5)任一：

(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基的第37位的亮氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βL37P，βL37K，βL37D，βL37A，βL37F；

(2)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第41位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βF41P，βF41K，βF41D，βF41A；

(3)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的腈水合酶β亚基第46位的酪氨酸分别突变为脯氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸中的一种得到的，分别命名为：βY46P，βY46K，βY46D，βY46A，βY46F；