[发明专利]一种检测沙门氏菌的适体生物传感器及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种快速检测沙门氏菌的适体生物传感器，其特征在于，包括由SMBs-cDNA2复合物、适配体Apt2和AuNPs-cDNA3探针建立的夹心结构SMBs-Apt2-AuNPs，和被用作荧光信号的以DNA为模板合成的银纳米簇DNA-AgNCs；所述SMBs-cDNA2复合物由链霉亲和素磁珠与生物素修饰的核酸链cDNA2连接，cDNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AuNPs-cDNA3探针由AuNPs溶液与巯基修饰的cDNA3制备而成，cDNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；所述适配体Apt2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述DNA模板的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

在没有沙门氏菌的情况下，SMBs-Apt2-AuNPs系统保持完整性，当加入DNA-AgNCs时，系统中的AuNPs与AgNCs发生荧光共振能量转移以猝灭AgNCs的荧光；在有沙门氏菌的情况下，在上清液中悬浮的AuNPs-cDNA3探针和结合Apt2的沙门氏菌通过磁分离被去除，从而导致荧光不被猝灭。

2.权利要求1所述适体生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备SMBs-cDNA2复合物：SMBs经1×BW缓冲液洗涤后，重悬于2×BW缓冲液中，加入等体积的cDNA2溶液孵育，去除上清，经1×BW缓冲液洗涤后，重悬于PBS溶液中，得到SMBs-cDNA2复合物；

(2)制备AuNPs-cDNA3探针：将巯基修饰的cDNA3与AuNPs溶液混合，孵育后加入磷酸缓冲液A，再次进行孵育，分多次缓慢加入含有2mol/LNaCl的磷酸缓冲液B进行老化，直至溶液中NaCl浓度达到0.01mol/L～2mol/L，离心后用去离子水重悬获得AuNP-cDNA3探针；

(3)制备SMBs-Apt2-AuNPs系统及合成DNA-AgNCs：将Apt2、SMBs-cDNA2复合物和AuNPs-cDNA3探针在PBS溶液中混合并进行孵育，磁分离去除上清，再用PBS溶液洗涤三次获得SMBs-Apt2-AuNPs系统；向含有DNA模板的PB溶液中加入AgNO₃溶液，于黑暗中进行孵育，加入NaBH₄剧烈震荡，使用前避光稳定，以使用的DNA浓度即为制备的DNA-AgNCs的浓度。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述SMBs的用量为0.1-5mg，2×BW缓冲液的用量为20-500μL，PBS溶液的用量为20-500μL，所述cDNA2的浓度为0.5-5μmol/L；所述孵育温度为25-45℃，孵育时间为30-120min；所述最终得到的SMBs-cDNA2复合物的终浓度为1-20μg/μL。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述SMBs的用量为1mg，2×BW缓冲液的用量为200μL，PBS溶液的用量为200μL，所述cDNA2的浓度为2μmol/L；所述孵育温度为37℃，孵育时间为60min；所述最终得到的SMBs-cDNA2复合物的终浓度为5μg/μL。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)是将1～20μL浓度为10～500μmol/L的巯基修饰的cDNA3与1mL的AuNPs溶液混合，于30℃～70℃孵育5～24h，加入50-500μL磷酸缓冲液A，于30℃～70℃孵育0.1-2h，分多次缓慢加入含有2mol/LNaCl的磷酸缓冲液B进行老化，直至溶液中NaCl浓度达到0.01-2mol/L，离心后，用50-500μL去离子水重悬获得AuNP-cDNA3探针。

6.根据权利要5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述巯基修饰的cDNA3的体积为8μL，浓度为100μmol/L；所述磷酸缓冲液A的添加量为100μL，加入磷酸缓冲液A前的孵育温度为50℃，孵育时间为12h；加入磷酸缓冲液A后的孵育温度为50℃，孵育时间为1h；所述老化结束的时间为NaCl浓度达到0.2mol/L；所述去离子水的用量为200μL。