[发明专利]BCG基因BCG_1246c在制备结核疫苗重组BCG中的应用

说明书

本发明提供了一种BCG重组菌ΔBCG_1246c，该BCG重组菌中的基因BCG_1246c被敲除。本发明还提供了该BCG重组菌的制备方法以及其在制备结核疫苗中的应用。本发明提供的BCG重组菌ΔBCG_1246c可以诱导巨噬细胞产生更多的抗菌肽，给予宿主更强的抵抗结核菌感染的能力，有潜力作为结核菌的候选疫苗。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及BCG基因BCG_1246c在制备结核疫苗重组BCG中的应用。

背景技术

结核病在世界范围是细菌性传染病的主要死亡原因。由于缺乏对成年人肺结核有效的预防性疫苗，全球结核病形势依然严峻。目前唯一获得临床使用许可用于预防结核病的疫苗是卡介苗(Mycobacterium bovisbacille Calmette-Guérin，BCG)，这是一种减毒活疫苗。卡介苗于1921年在巴黎首次给新生儿注射¹。到 2019年，全球88％的儿童在出生后第一年接受卡介苗接种²。卡介苗对新生儿和学龄儿童的结核性脑膜炎具有70％以上的保护作用³。然而，对成年人肺结核的保护效果非常有限。21世纪初，全球新型结核病疫苗的研发力度不断加大。这些包括Mtb融合蛋白的亚单位佐剂制剂、表达Mtb一种或多种抗原的病毒载体疫苗、灭活分枝杆菌疫苗和减毒分枝杆菌疫苗^4,5。

新结核病疫苗的开发遵循两条基本途径^6,7。第一种途径是用改良的重组卡介苗(rBCG)或基因敲除减毒的结核分枝杆菌取代卡介苗。基因改良rBCG的特点应该是：a)更安全；b)免疫原性更强；c)诱导更持久的保护；d)对高毒力临床分离株具有保护作用，如结核分枝杆菌北京株、多耐药菌株(MDR)、广泛耐药结核病菌株(XDR)等。重组卡介苗的一种方法是引入卡介苗中缺乏的免疫原性结核菌特异性抗原，如RD1编码的结核抗原基因(ESAT6，CFP10)；或者通过过表达卡介苗自身抗原(Ag85复合物的同源物等)。另一种重组卡介苗的方法是对现有卡介苗进行基因编辑，以更好地增强宿主天然免疫反应⁸。除了这两种rBCG疫苗方法外，另外一种开发结核疫苗的策略是对结核分枝杆菌进行减毒。这包括删除必需的代谢基因以产生营养缺陷型突变体，或主要缺失毒力基因及其调控因子。一项研究表明在田鼠分枝杆菌上表达结核分枝杆菌的RD1抗原显著提高了宿主对结核菌感染的抵抗能力⁹。还有研究发现重组耻垢分枝杆菌也可以作为结核疫苗。当耻垢分枝杆菌敲除esx-3基因时，可以看到免疫小鼠出现强烈的先天免疫反应。当这种重组耻垢分枝杆菌回转入结核菌的esx-3基因时，在小鼠结核菌攻毒模型中观察到对宿主更好的保护活性。

开发结核病疫苗的第二个主要途径是构建亚单位疫苗。这些疫苗是非活体疫苗，或者以病毒为载体的非复制疫苗。结核病的亚单位疫苗主要是重组蛋白，或使用减毒病毒载体。虽然亚单位疫苗理论上可以用作启动疫苗，但目前主流观点是，它们只能用作辅助卡介苗、重组卡介苗或减毒Mtb疫苗之上的增强疫苗。

目前临床使用的BCG卡介苗对肺结核患者的保护效果有限，构建重组卡介苗是主要研究方向。重组卡介苗的主要研究策略是敲除BCG的毒力基因，激活宿主的免疫应答功能，提高现有疫苗BCG的保护效果。但是哪些基因是BCG 重要的免疫抑制因子尚不明确，以哪个靶点为基础对BCG进行基因编辑可以提高BCG的保护效果还缺少理论基础。

抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)被认为是生物体先天免疫系统的古老防御武器，具有广泛的对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌、寄生虫和病毒的活性。AMPs通常由12-15个氨基酸组成，带有阳离子(由带正电的精氨酸和赖氨酸残基组成)¹⁰，其作用机制的是与带负电的菌体膜形成相互作用，从而产生磷脂置换、膜结构紊乱和内部化¹¹。由于AMPs的作用机制不同，因此微生物很少产生耐药性。本发明基于宿主的抗菌肽，寻找显著抑制其表达的BCG毒力基因，为构建效果更好的重组卡介苗提供策略。

发明内容