[发明专利]一种用于高盐稀态酱油微生物宏蛋白质组学分析的样本制备方法

说明书

本发明属于新工艺技术领域，公开了一种用于高盐稀态酱油微生物宏蛋白质组学分析的样本制备方法。本发明通过纱布过滤前处理和多种试剂盒的组合与应用，并利用超滤管的分子筛作用，快速除盐除杂，得到高质量的蛋白样品，经烷基化、酶切后所得多肽，可用于nLC‑MS检测，进行高盐稀态酱油宏蛋白质组学信息分析。方法中首次使用纱布过滤前处理减少高盐稀态酱油样本中大豆对微生物蛋白提取的影响，首次组合两种试剂盒提取浓缩，并改良操作步骤，可获得更高纯度的蛋白，结合超滤管的使用，快速除盐除杂。综合以上，该方法操作简便，实验速度快，蛋白质量高。

技术领域

本发明涉及新工艺技术领域，具体为一种用于高盐稀态酱油微生物宏蛋白质组学分析的样本制备方法。

背景技术

高盐稀态酱油是中国传统酿造酱油的一个重要流派，形成于以广东为主的华南地区。该类酱油以全大豆和面粉为主要原料，经3个月以上的日晒夜露天然酿造而成，酱油发酵经过多种微生物共同作用形成其独特的香味，每种微生物在酱油酿造过程中不同时段的具体作用很难确切描述，尤其是采用常温高盐稀态发酵工艺，周期长，受自然环境影响较大，使得微生物之间的相互作用更加复杂。在酱油发酵过程中，微生物的种群结构及相互代谢调控对酱油色、香、味和体态的形成和品质起到了关键的作用。

随着生物化学和分子生物学技术的发展应用，运用非培养的生理生化方法和分子生物技术实现了对环境中89％～99％不可培养或未培养微生物的检测，对微生物进行更全面而深入的了解。特别是宏基因组、宏转录组、宏蛋白组和宏代谢组技术的应用，使得人们可以更系统深入地研究发酵食品微生物群落结构及其功能基因，全面分析其组成、变化规律、亲缘进化并挖掘出潜力丰富的功能基因，从而得以进一步揭开高盐稀态酱油微生物群落的神秘面纱。

因为高盐稀态酱油发酵周期长，微生物菌落复杂，目前鲜有高盐稀态酱油宏蛋白质组学的研究。蛋白质组学样本的制备是获得高质量质谱数据的关键，适宜的蛋白样本制备技术可以获得更为丰富且贴合实际生产的高盐稀态酱油发酵过程的宏蛋白组学信息。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种用于高盐稀态酱油微生物宏蛋白质组学分析的样本制备方法，以解决上述背景技术提出的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明通过纱布过滤前处理和多种试剂盒的组合与应用，并利用超滤管的分子筛作用，快速除盐除杂，得到高质量的蛋白样品，经烷基化、酶切后所得多肽，可用于nLC-MS检测，进行高盐稀态酱油宏蛋白质组学信息分析。

本发明的目的通过下述方案实现：

取高盐稀态酱醪50g，水黄50ml，充分混匀，纱布过滤，取滤液，转移至50ml离心管，3000×g，4℃，离心5min，弃上清，得到菌沉淀。用无菌水清洗2次。

加入等体积蛋白提取液，珠磨仪4℃研磨3min，每研磨30s，间隔20s。冰上放置1h，每十分钟用枪头吸打混匀1次。

冰上超声5min，20000×g，4℃，离心15min，将上清转移至预冷的新的离心管。

采用BCA试剂盒，测定蛋白含量。

取200ug蛋白液，加入1/4体积沉淀剂A，涡旋震荡10s，冰上静置1h，20000×g，4℃，离心10min，加入600ul洗涤液B,涡旋震荡10s，冰上静置10min，转移至超滤管，13500×g，4℃，离心10min，弃滤液，超滤管中加入400ul一级水吸打均匀，13500×g，4℃，离心10min，弃滤液。

超滤管中加入100ul蛋白提取液溶解蛋白，加入终浓度为50mM的DTT,60℃，保温40min，冷却至室温，加入55mM的IAM，避光反应40min，13500×g，4℃，离心10min，弃滤液。