[发明专利]一种用于高盐稀态酱油微生物宏蛋白质组学分析的样本制备方法

权利要求书

1.一种用于高盐稀态酱油微生物宏蛋白质组学分析的样本制备方法，其特征在于，通过纱布过滤前处理和多种试剂盒的组合与应用，并利用超滤管的分子筛作用，除盐除杂，得到高质量的蛋白样品，经烷基化、酶切后所得多肽，可用于nLC-MS检测，进行高盐稀态酱油宏蛋白质组学信息分析。

2.根据权利要求1所述的一种用于高盐稀态酱油微生物宏蛋白质组学分析的样本制备方法，其特征在于，取高盐稀态酱醪50g，水黄50ml，充分混匀，纱布过滤，取滤液，转移至50ml离心管，离心力为3000×g，温度4℃，离心5min，弃上清，得到菌沉淀，采用无菌水清洗2次。

3.根据权利要求2所述的一种用于高盐稀态酱油微生物宏蛋白质组学分析的样本制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、加入等体积蛋白提取液，采用珠磨仪在温度4℃条件下研磨3min，每研磨30s，间隔20s，冰上放置1h，每十分钟用枪头吸打混匀1次；

步骤二、冰上超声5min，离心力20000×g，温度4℃，离心15min，将上清转移至预冷的新的离心管；

步骤三、采用BCA试剂盒，测定蛋白含量，样品蛋白浓度为0.5ug/ul；

步骤四、取200ug蛋白液，加入1/4体积沉淀剂A，涡旋震荡10s，冰上静置1h，离心力20000×g，温度4℃，离心10min，加入600ul洗涤液B涡旋震荡10s，冰上静置10min，转移至超滤管，离心力13500×g，温度4℃，离心10min，弃滤液，超滤管中加入400ul一级水吸打均匀，离心力13500×g，温度4℃，离心10min，弃滤液；

步骤五、超滤管中加入100ul蛋白提取液溶解蛋白，加入终浓度为50mM的DTT,60℃，保温40min，冷却至室温，加入55mM的IAM，避光反应40min，离心力13500×g，温度4℃，离心10min，弃滤液；

步骤六、超滤管中加入400ul一级水吸打均匀，13500×g，4℃，离心10min，弃滤液，超滤管中加400ul 25mM NH₄HCO₃吸打均匀，离心力13500×g，温度4℃，离心10min，弃滤液。超滤管中截流为样本蛋白；

步骤七、超滤管中加入100ul 25mM NH₄HCO₃，按蛋白：酶为1:50，加入胰蛋白酶，酶切15h，离心力13500×g，温度4℃，离心10min，取滤液，为制备好的多肽样本，可供nLC-MS检测，进行高盐稀态酱油的宏蛋白质组信息分析。