[发明专利]SLC35E1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

说明书

本发明公开了SLC35E1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用，属于生物技术领域。构建方法包括：根据SLC35E1基因序列确定SLC35E1小鼠待敲除基因的两对特异性靶点gRNA1和gRNA2、gRNA3和gRNA4，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA，显微注射入小鼠受精卵并移植至代孕母鼠输卵管内，待产出小鼠后传代培养，经基因型鉴定得到稳定遗传的SLC35E1基因敲除小鼠动物模型。通过构建的SLC35E1基因敲除小鼠动物模型研究银屑病或分枝杆菌感染性疾病，并验证SLC35E1基因在制备和筛选治疗银屑病或分枝杆菌感染性疾病药物中的应用，为人分枝杆菌感染性疾病的作用机制和治疗提供依据。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及SLC35E1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用。

背景技术

溶质转运载体35(Solute carrier 35，SLC35)家族，属于SLC家族中的第35个成员，分为7个亚型(A-G)，是一种由300–400个氨基酸组成的疏水性蛋白质，属于Ⅲ型跨膜转运蛋白分子。SLC35多数成员定位在高尔基复合体膜上，另有一小部分定位在细胞膜上，主要转运细胞内相应单糖核苷酸并保证糖基化过程的顺利进行，SLC35被认为是糖基化途径中的关键调节因子。对SLC35缺陷型多细胞生物的生长发育研究及病理表型分析发现，SLC35转运蛋白缺乏可参与多种结缔组织病和遗传性疾病的发生，并且在肿瘤的发生及其转移等许多病理过程中发挥重要作用。

现有技术中，已知SLC35缺陷引起的疾病包括人类II型遗传性糖基化紊乱(CDGIIc)和II型遗传性包涵体肌病两种，近来还发现SLC35家族中某些成员与肿瘤的关系密切。此外，有研究显示在麻风患者中SLC35D1、SLC35D2的mRNA表达水平升高，提示SLC35D家族在麻风发病机制中可能具有重要作用，研究还发现SLC35E1在麻风病中发挥重要作用，通过对8个家系29个麻风患者及正常对照组进行全外显子测序，进一步扩大验证后发现麻风病患者研究中存在SLC35E1位点的突变；结合临床症状分析发现，SLC35E1是与皮损改变相关的易感基因。同时，SLC35E1的另一亚型SLC35E2B在斑块型银屑病患者的全外显子测序中被发现是突变基因，由此推断SLC35E1也可能参与银屑病的发病。

目前有关SLC35E1的研究甚少，其功能尚不清楚，SLC35E家族的成员SLC35E2B缺陷时可出现免疫缺陷及肌肉萎缩等症状，这与麻风病免疫功能紊乱及肌肉萎缩有相似临床症状，推测中国的麻风病患者发病可能与SLC35E2B基因突变有关。因此，建立敲除SLC35E1基因的C57小鼠模型，并在此基础上构建银屑病及分枝杆菌感染的模型对探究SLC35E1在银屑病及分枝杆菌感染中发挥的作用、相关机制及可能参与的分子通路具有重要意义，同时为指导银屑病和分枝杆菌感染性疾病的治疗提供新的理论依据。

发明内容

本发明的第一目的是提供SLC35E1基因敲除小鼠动物模型的构建方法。

本发明的第二个目的是提供SLC35E1基因在制备和筛选治疗银屑病或分枝杆菌感染性疾病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的SLC35E1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建得到，包括以下步骤：

(1)根据SLC35E1基因序列确定SLC35E1小鼠待敲除基因的两对特异性靶点gRNA1和gRNA2、gRNA3和gRNA4，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA；

(2)将两对特异性靶点gRNA1和gRNA2、gRNA3和gRNA4和mRNA一起显微注射入小鼠受精卵内，显微注射后的受精卵移植至代孕母鼠输卵管内；

(3)待产出小鼠后继续传代培养，经基因型鉴定，得到稳定遗传的SLC35E1基因敲除小鼠动物模型；