[发明专利]在哺乳动物肌肉中特异性启动基因的启动子序列及其应用

说明书

本文提供了能够在肌肉组织中特异性表达的嵌合启动子，其包括：肌肉特异性转录因子识别结合位点；肌肉特异性顺式调节模块；以及肌肉特异性启动子。本文还提供了包括该嵌合启动子的表达盒、表达载体、病毒颗粒，以及它们的治疗应用。

技术领域

本发明涉及启动子，尤其是能在哺乳动物肌肉组织中特异性启动基因表达的嵌合启动子。本发明还涉及该嵌合启动子的医疗应用。

背景技术

遗传性肌肉疾病往往由于骨骼肌和心脏功能障碍导致较高的发病率和死亡率，目前尚缺乏有效的治疗方法。基因治疗是一种有效的、具有前景的治疗遗传病方法，正处于高速发展阶段，为包括肌肉疾病在内的许多遗传疾病提供了希望。病毒载体，包括慢病毒、腺相关病毒等载体是基因治疗传递基因的常用工具。但实现在肌肉细胞高效递送基因目前仍具有一定的挑战。通过开发肌肉组织特异性启动子增强病毒载体药物特定组织表达，减少递送基因的非特异性表达，达到病毒载体可控释放药物及降低病毒使用量是提高病毒载体在遗传性肌肉疾病基因治疗运用的一种有效的方法。

人类Desmin基因编码一种中间丝结构蛋白，在心肌、骨骼肌、平滑肌等肌肉细胞均有合成。Desmin基因在肌肉细胞的特异性表达主要受到启动子区域元件严格的调控。Desmin基因启动子作为肌肉组织特异性启动子已被多篇文章报道，其中包含-973--693及-228-0的截短体具有较高的表达效率^[1]。但其递送效率仍存在不足之处。CRM4顺式增强元件，由Sarcar S等人报道的在小鼠肌肉细胞具有良好的特异性^[2]。Myod1转录因子（Myoblast determination protein 1）作为转录激活剂，促进肌肉特异性靶基因的转录，并在肌肉分化中发挥作用。但目前未见有将它们进行组合而获得活性和特异性更高的启动子的报道。

发明内容

本文公开了一种人工优化的能在哺乳动物肌肉中特异性启动基因转录的启动子序列及其应用。该启动子通过添加CRM4顺式增强子元件、Myod1转录因子识别序列以及SV40intron序列对人类Desmin基因启动子进行优化。通过小鼠体内实验，经优化后的人类Desmin基因启动子其组织特异性及表达能力得到了较大的提高，具有较高的应用价值。

一方面，本文提供了肌肉特异性嵌合启动子，其包括：

1) 第一转录调控元件，所述第一转录调控元件为肌肉特异性转录因子识别结合位点；

2) 第二转录调控元件，所述第二转录调控元件为肌肉特异性顺式调节模块；以及

3) 第三转录调控元件，所述第三转录调控元件为肌肉特异性启动子。

在一些实施方案中，所述肌肉特异性嵌合启动子中所述第一转录调控元件的数量为两个或两个以上。

在一些实施方案中，两个或两个以上所述第一转录调控元件串联连接或被所述第二转录调控元件和/或所述第三转录调控元件隔开。

在一些实施方案中，所述第一转录调控元件的数量为两个，分别位于所述第二转录调控元件或所述第三转录调控元件两侧。

在一些实施方案中，所述肌肉特异性嵌合启动子还包括第四转录调控元件，所述第四转录调控元件为内含子序列。

在一些实施方案中，所述第四转录调控元件为SV40内含子序列。

在一些实施方案中，所述肌肉特异性转录因子为Myod蛋白家族的成员。

在一些实施方案中，所述肌肉特异性转录因子为Myod1转录因子。

在一些实施方案中，所述第一转录调控元件包括SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO: 1有至少90%序列一致性的功能性变体。