[发明专利]非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用

说明书

本发明公开了非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用。本发明的非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株已于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23098。本发明采用非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒抗原，较传统转瓶培养工艺、较大的简化了生产工艺，降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，尤其涉及非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株及其应用。

背景技术

乙型脑炎又称日本脑炎(Japanese encephalitis，JE)，简称乙型脑炎，是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis Virus，JEV)引起的一种人畜共患传染病，我国将猪乙型脑炎归为二类动物疫病，猪乙型脑炎病毒归为第三类动物病原微生物。本病经由蚊虫媒介而传播，有严格的季节性，流行于6～10月，集中于7、8、9三个月。同时蚊虫也是本病毒的长期储存宿主，猪为最主要的增殖宿主和传染源，人群中以儿童感染发病率较高。动物感染发病症状表现为发病急，高温高热，流产，死胎，病死率较高。在该病流行期间，猪对乙型脑炎病毒感染率几乎可达100％，但很多时候处于隐形感染状态，成为人乙型脑炎感染的主要来源。

目前，已有4种不同类型的JEV疫苗：鼠脑灭活疫苗、细胞培养灭活疫苗、细胞培养减毒活疫苗和基因工程减毒活疫苗。兽用乙型脑炎疫苗主要为鼠脑灭活疫苗和地鼠肾细胞乙型脑炎活疫苗。现有的猪乙型脑炎疫苗均存在一定的问题，如由鼠脑制备的疫苗存在成本高、杂蛋白多和易导致过敏反应等弊端，地鼠肾细胞活疫苗存在成本高，操作复杂，批间存在差异等弊端。

Vero细胞来源于非洲绿猴肾传代细胞，其优点是易于大规模培养，胞核学稳定，无外源因子污染，无致瘤性，是WHO推荐使用的人用疫苗生产基质，适用于大规模疫苗生产用的细胞源。此外，国内商品化猪乙型脑炎疫苗均采用传统转瓶培养方式，存在细胞易污染、劳动强度大等缺点。与转瓶培养工艺相比，反应器悬浮培养采用无血清培养，获得的细胞密度、病毒效价、产品质量均明显提高，无血清性外源病毒污染，生产能耗大幅降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株。

本发明所提供的非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株，命名为Vero-zm，已于2021年10月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23098。

本发明的的非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株可用于病毒生产中，还可以用于生产疫苗中。

本发明的另一个目的是提供一种制备猪乙型脑炎病毒抗原的方法。

本发明所提供的制备猪乙型脑炎病毒抗原的方法，包括：

采用非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒；

收获所述猪乙型脑炎病毒液，添加硫酸鱼精蛋白，经离心、过滤、浓缩、分子筛凝胶层析，得到猪乙型脑炎病毒抗原。

其中，所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株在V-SFM培养基上进行复苏和扩大培养。

其中，所述硫酸鱼精蛋白的终浓度1-2mg/ml。

其中，所述猪乙型脑炎病毒为猪乙型脑炎病毒SA14-14-2。

其中，在采用所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒中，所述病毒接种后孵育阶段的生物反应器的参数为：温度36～37℃，pH值7.2±0.1，溶氧40～60％，搅拌速度40～80rpm，通气量0.1～0.5SPLM。

其中，在采用所述非洲绿猴肾细胞的全悬浮细胞株生产猪乙型脑炎病毒中，所述病毒孵育后的培养阶段的生物反应器的参数为：温度33～35℃，pH值7.4～7.8，溶氧40～60％，搅拌速度80～120rpm，通气量0.1～0.5SPLM。