[发明专利]一种检测副溶血性弧菌的CDA引物组、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediated Isothermal Amplification of nucleic acids，CDA)的副溶血性弧菌快速检测技术。本发明公开了一种检测副溶血性弧菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对副溶血性弧菌的保守区片段扩增的引物组，为引物对VP‑F2/VP‑R2和引物对VP‑MF/VP‑MR；其中，VP‑F2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，VP‑R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；VP‑MF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，VP‑MR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明提供的方法或可视化试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作即可完成对副溶血性弧菌的快速准确检测，因此，适用于专业程度不高的机场、海关、口岸、社区等地的现场快速检测。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测副溶血性弧菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

副溶血性弧菌是一种嗜盐生长的革兰氏阴性多形态球杆菌，广泛存在于海洋环境中。其菌体呈弧状、杆状、或丝状，无芽孢且无荚膜。此菌含有细胞色素氧化酶，不分解蔗糖，但能在不产气及不产生硫化氢的情况下分解葡萄糖而产酸等生化特性。由于副溶血性弧菌为一嗜盐性细菌，必须在含盐0.5％～8％的环境中方可生长，且以含盐量在2％～4％的情况下最佳。副溶血性弧菌能够在温度为5～44℃范围内生长，但以30～35℃为最佳，当温度低40℃时则停止生长；适宜生长的pH为7.5～8.5，以pH7.7为最佳，在pH低于6的酸性条件下则生长不佳。

副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。人们食用被副溶血性弧菌污染的食物后极可能会引起以腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热等为主要症状的急性肠胃炎。其特征之一为中毒者的粪便多呈水样，且常混有粘液或脓血。此外，重症患者还可出现脱水、休克昏迷，甚至死亡的症状，故副溶血性弧菌又有肠炎弧菌之称。由该菌引起的食物中毒案例在世界各地均有报道，因此，针对食物中的副溶血性弧菌进行定性或定量检测非常重要。

现有的检测方法主要包括PCR、DNA探针技术等。尽管这些技术能快速检测样品中总的或致病性副溶血性弧菌的数量，但这些方法依赖于特殊而昂贵的设备，且其操作过程复杂费时(包括DNA的分离、杂交、比色以及探针和引物的合成等)，只有熟练掌握了其操作技巧的技术人员才能完成测试。因此，以上方法并不适用于现场快速检测，建立一种快速、灵敏、特异的副溶血性弧菌检测方法迫在眉睫。

基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediatedIsothermal Amplification ofnucleic acids，CDA)是国科宁波生命与健康产业研究院开发的替代日本LAMP核酸扩增的方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在恒温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱中便可完成，仪器设备要求低，较传统PCR和培养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成，且扩增结果可结合金属离子指示剂羟基萘酚兰(HNB)，通过肉眼观察颜色变化以实现对结果的判断，使其适用于基层医疗机构及地方检验检疫部门。并且，CDA还可以大大缩短操作时间，减少样品污染机会，适合应用于副溶血性弧菌的快速诊断。此外，CDA所用关键成环引物约为30bp，较LAMP中成环引物40bp短，这将极大程度的节约成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测副溶血性弧菌的CDA引物组、试剂盒及其应用。解决现有技术中操作复杂、成本高的技术问题。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

一种非疾病诊断目的的检测副溶血性弧菌的CDA引物组，所述CDA引物组为以下两对引物：