[发明专利]一种大肠杆菌肠毒素多表位融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种大肠杆菌肠毒素多表位融合蛋白及其制备方法和应用，本发明以产肠毒素大肠杆菌不耐热肠毒素A(LTa)作为骨架蛋白，将产肠毒素大肠杆菌耐热肠毒素A(STa)和B(STb)的中和表位替换LTa免疫原性较弱的表位，通过融合表达制备重组蛋白；所得重组蛋白能够高效表达，且可以将STa和STb的表位展示出来，有效解决了因STa和STb分子量较小导致的免疫原性较弱、表达量差等问题。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及了一种大肠杆菌肠毒素多表位融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的主要病原菌。据报道，全世界每年因ETEC造成仔猪死亡约占一半以上，给生猪养殖业造成巨大的损失。ETEC主要的致病因素是其产生的肠毒素，包括耐热型肠毒素A(STa)、耐热型肠毒素B(STb)、不耐热型肠毒素A(LTa)和不耐热型肠毒素B(LTb)。其中，耐热型肠毒素具有较强的致病性，可使仔猪肠道黏膜萎缩，脱落，诱发炎症，导致仔猪腹泻，进而死亡。除此之外，STa和STb还能够污染水源、食物等，有研究表明ETEC是发展中国家幼儿死亡的重要原因之一，也是人类公共卫生的一个重要危险。然而，由于STa和STb分子量较小，免疫原性较弱，表达量差，毒性强等问题，目前市场上，还未开发出针对STa和STb的有效的疫苗或中和活性的抗体。研究如何能够展示STa和STb抗原表位，已经成为一个研究热点。

多表位融合抗原是一种基于抗原结构和表位的疫苗技术，为多价疫苗的开发提供了新的平台。通过模拟抗原的天然表位并呈递多个异源中和表位，多表位融合抗原允许单个免疫原(蛋白质)携带来自多种毒力决定簇的多种抗原性元素(表位或肽)，从而具有广泛的免疫原性，可以广泛开发免疫原性多价疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明利用LTa作为骨架蛋白，将STa和STb中和表位展示在LTa上得到重组蛋白，能有效解决STa和STb分子量较小，免疫原性较弱，表达量差，毒性强等问题，并有望改善仔猪腹泻频发、死亡率高、疫苗保护效率差等现状。

本发明的技术方案具体如下：

本发明第一方面提供了一种大肠杆菌肠毒素多表位融合蛋白，具体为如下任一：

(i).氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白质；

(ii).将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

(iii).在(i)或(ii)所述蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的蛋白质。

本发明第二方面提供了制备上述大肠杆菌肠毒素多表位融合蛋白的方法，包括以下步骤：

S1.克隆LTa基因，筛选LTa免疫原性较弱的表位，克隆STa的中和表位和STb的中和表位，将所述STa和STb的中和表位替换LTa免疫原性较弱的表位；

S2.将替换后的基因克隆在载体上，构建重组载体，转入宿主菌株中进行诱导表达；

S3.提取纯化目的蛋白。

优选地，所述LTa免疫原性较弱的表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；所述STa中和表位的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，克隆所述STa中和表位所用的引物序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示；所述STb中和表位的氨基酸序列SEQ ID NO:7所示，克隆所述STb中和表位所用的引物序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示。

优选地，所述载体为PET质粒，包括但不限于：PET28a、PET30a、PET32a。