[发明专利]一种UDG酶的酶活测定组合物及测定方法

说明书

本发明公开了一种UDG酶的酶活测定组合物及测定方法，该测定组合物包括含U碱基的UDGA荧光探针和UDG酶测活缓冲液，利用现有的已精确标定酶活的商品化的UDG酶和含U碱基的荧光探针系统反应，用荧光定量PCR仪设定条件进行反应后，以荧光量和UDGA探针不同浓度得到标准曲线，求出K值，然后获得待测酶合适的稀释倍数以便荧光量可以落在标准曲线范围内，然后用待测酶的荧光量除以K值，在根据倍数换算得到的酶活。本发明变异系数在11.03％以内，实验偏差为在0.74％以内。所以我们认为UDG酶测活方法可行，从而将极大的克服现在行业内普遍存在的UDG酶活测定灵敏度偏低，损耗时间长，操作繁琐等缺点。

技术领域

本发明涉及DNA糖基化酶技术领域，具体为尿嘧啶DNA糖基化酶检测体系及其检测方法。

背景技术

分子信标(Molecularbeacon)是一种荧光标记的寡核苷酸链。一般有三部分组成：①环状区：由15～30个可以与靶分子特异结合的核苷酸组成；②茎干区：一般由5～8个可发生可逆性解离的碱基对组成；③荧光基团和淬灭基团：分子信标的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。如概述图所示，没有靶分子的时候，分子信标的荧光和淬灭基团靠得很近，荧光被淬灭。与靶分子结合后，分子信标的空间构型发生改变，导致荧光恢复。因为分子信标技术具有极高的特异性和灵敏度，所以在临床诊断、基因检测、环境监测、活细胞成像、基因芯片与生物传感等方面得到了广泛应用。最近几年，为了提高检测目标分子的灵敏度，循环扩增技术在分子信标中的应用成为了研究热点，并广泛地应用于了各类目标分子的检测中去。

DNA糖基化酶是一类在碱基切除修复(BER)过程中负责损伤碱基识别和切除的起始酶，它的功能的异常会导致碱基切除修复机制无法运行，从而引发多种疾病，如人类免疫缺陷、神经退行性变、淋巴瘤、绽放综合征以及乳腺癌等。因此，尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的超灵敏检测对于基础生物医学的研究和人类各种疾病的早期临床诊断有着十分重要的作用。到目前为止，已发展出多种方法用于尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的检测，其中凝胶电泳结合放射性标记被认为是检测方法中的“黄金标准”。但是该方法具有一些无法克服的缺点，如放射性污染，检测灵敏度低，以及消耗时间长等。近年来已研发出一些新的用于检测尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的方法，如比色分析法，电化学分析法和以及荧光分析法。其中，比色分析法通过过氧化氢氧化2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS2-)产生有色的ABTS-，使尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的活性可视化，但是其检测灵敏度无法与电化学方法和荧光方法相比。电化学分析方法在一定程度上提高了检测灵敏度，但是需要将捕获探针固定在固化载体上以及需要提前制备石墨烯电极，既耗时又费力。荧光方法设计简单，操作方便，但无法避免检测灵敏度低以及信号不稳定等缺点。综上，尽管这些检测尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的方法有效，但是仍然存在灵敏度偏低，损耗时间长，操作繁琐等缺点。

发明内容

基于上述情况，我们公开了一种UDG酶的酶活测定组合物及测定方法，解决上述技术问题。

本发明采用荧光探针法进行酶活相对定量测定，我们设计一个含U碱基的荧光探针，在37℃恒温条件下，UDG酶特异性识别且切除荧光探针UDGA的U碱基，使探针断裂，发光基团和淬灭基团分开，测得荧光推算出酶活性。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种UDG酶的酶活测定组合物，包括去RNA酶水、UDGA探针、UDG酶标准品、UDG酶测活缓冲液和Endo VIII酶，所述UDGA探针为发夹型结构，两端分别连接发光基团和猝灭基团，直链部分包含U碱基。

优选的，所述UDG酶测活缓冲液的配方包括：去RNA酶水、20mM Tris8.0、10mMNaCl、1mM DTT、0.1mM EDTA、0.05％CA630、0.05％Tween 20、2％Glycerol和0.1mg/ml BSA。