[发明专利]一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细胞外囊泡计数的方法及其应用所述方法包括：将细胞外囊泡(EVs)与抗体偶联核酸复合物一起孵育，所述抗体偶联核酸复合物由EVs普适性表达和/或特异的抗体与核酸偶联而成；然后将EVs和抗体偶联核酸复合物的混合物与引物、探针一起配制成反应体系，经液滴生成仪产生微液滴，实现单个EV的包裹，将所述液滴用PCR仪进行热循环扩增反应，随后通过液滴生成仪识别读取液滴，从而对EVs亚群进行分离分析。本发明能实现EVs数字化绝对定量，只需更换抗体就可实现多种EV亚群的精准检测分析；技术简单、稳定、成熟，利用普通PCR仪就可实现临床疾病诊断，利于临床推广转化。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种单囊泡膜蛋白表达谱分析用于多亚群细 胞外囊泡计数的方法及其应用。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由细胞向细胞外环境释放的直径在 30-2000nm的具有脂质双分子层膜的膜性结构。细胞把特异的生物活性分子如微小核糖核酸、 蛋白质等包裹到EVs中或结合于EVs表面，使其稳定地存在于几乎所有生物液体中，如血 清、尿液、羊水、脑脊液和唾液等，可以通过非侵入性的方式获得。从EVs的首次发现至今， 有关EVs的研究突飞猛进。特别是近年来，随着EVs作用机制及其与疾病之间关系的深入 研究，证实EVs已成为一类具有广阔应用前景的新型生物标志物。但是，EVs可被任何有核 细胞分泌，事实上，真正具有疾病诊断作用的是那些具有疾病特异蛋白或者核酸的EVs亚群。 因此，对EVs特异亚群的精准检测是目前EVs用于疾病诊断中越来越受关注的一个研究方 向，并且对EVs亚群的研究能推进人类个体疾病的精确化诊治。

由于传统的EVs检测技术，如纳米粒子跟踪分析(nanoparticle trackinganalysis,NTA) 测定EVs浓度，酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)或免疫印 迹实验(Western blot)评价EVs蛋白含量，Northern印迹、微阵列杂交、RT-PCR等检测 EVs携带的核酸，需要样本量较大，操作步骤繁琐，不适用于临床检测。近年来，关于EVs 检测技术日趋成熟，涌现出一批EVs检测平台，如光学、电学(电化学和电动力学)和小型 微流控技术平台等，显著提高了EVs检测的灵敏度与特异度，缩短了检测时间，并将其用于 前列腺癌、肝癌、结直肠癌等疾病的诊断与预后监测。然而，这些检测技术均停留在EVs批 量分析水平，忽略了EVs的个体差异，会忽视、掩盖或者遗失单个EV的所携带的分子信息， 限制了EVs的精准分析。