[发明专利]AFP检测用双酶共载纳米球及其制备方法、AFP检测方法

说明书

本发明提供了一种甲胎蛋白AFP检测用双酶共载纳米球及制备方法、探针、试剂盒及AFP检测方法，属于生物检测与酶负载材料领域。所述双酶共载纳米球包括：核‑壳结构磁性介孔二氧化硅纳米球，以及分布于介孔孔道中的葡萄糖氧化酶GoD和辣根过氧化物酶HRP；其中，所述核‑壳结构具有磁性内核颗粒和分布有介孔孔道的二氧化硅壳结构；所述磁性内核颗粒用于通过磁分离作用富集血清样本中的AFP；GoD和HRP用于催化底物显色。本发明通过核‑壳结构介孔纳米球提高了酶负载量，同时还通过超顺磁特性富集目标物，减少了生物样品引入的背景干扰，提高了检测的信号强度，从而提高了检测灵敏度；同时保证了检测稳定性，提高了检测准确度和精度。

技术领域

本发明属于生物检测与酶负载材料领域，具体涉及一种AFP检测用双酶共载纳米球及其制备方法、AFP检测方法。

背景技术

甲胎蛋白AFP由591个氨基酸组成，是胎儿发育早期由肝脏和卵黄囊合成的一种糖蛋白。正常人血清中AFP含量较低，在10 ng•mL^-1-20 ng•mL^-1之间。当肝细胞发生恶性病变时，AFP的浓度会急剧升高，是临床用于诊断原发性肝癌的常用标志物，对肝癌的确诊率在70%左右，同时其还与多种肿瘤的发生发展密切相关。当血清中AFP含量在2个月内均大于200 ng•mL^-1或在一个月内均大于400 ng•mL^-1时，即可判定为肝癌。因此，可通过对AFP的检测辅助对肝癌进行诊断。

现有技术中，血清中AFP的检测方法包括：酶联免疫吸附测定(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay, ELISA)比色法、磁微粒化学发光法、循环伏安法和线性扫描伏安法等。其中，磁微粒化学发光法、循环伏安法和线性扫描伏安法等方法具有检测灵敏度高、高度自动化等优势，但其检测仪器体积大，试剂价格昂贵，不适合单人份或小批量检测，尤其是在经济条件落后的基层医院、社区诊所、卫生院等，无法大面积推广使用；而ELISA方法利用96孔板作为载体，通过简单固定抗体作为捕获平台，然后将辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记的抗体作为检测探针，催化底物显色，具有操作简单、检测结果易判读等优势，但其检测灵敏度较低。

发明内容

本发明实施例针对生物酶检测技术中的酶负载量低、检测灵敏度不高等问题，提供了一种AFP检测用双酶共载纳米球及其制备方法、AFP检测方法，通过将双酶负载于核-壳结构磁性大孔介孔二氧化硅纳米球中，不仅通过大孔介孔二氧化硅超大比表面积负载更多的酶，同时还通过超顺磁特性富集目标物，以提高生物酶检测的信号强度，从而提高检测灵敏度。

为了实现上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：

第一方面，本发明实施例提供了一种AFP检测用双酶共载纳米球，所述纳米球包括：核-壳结构磁性介孔二氧化硅纳米球，以及分布于介孔孔道中的葡萄糖氧化酶GoD和辣根过氧化物酶HRP；

所述核-壳结构具有磁性内核颗粒和分布有介孔孔道的二氧化硅球形壳结构；所述磁性内核颗粒用于通过磁性分离作用富集血清样本中的AFP；所述葡萄糖氧化酶GoD和辣根过氧化物酶HRP用于催化底物显色。

负载有酶的载体进行生物检测时，酶的负载量会直接影响检测灵敏度。现有技术中使用的载体，一般是将酶负载在纳米粒子表面，负载的酶量受到纳米粒子比表面积的限制，导致检测灵敏度不高，影响检测结果的准确度及精度。

本实施例将用于AFP检测的双酶负载于具有核-壳结构的磁性介孔二氧化硅纳米球的介孔孔道中，不仅通过介孔的超大比表面积负载更多的酶，同时，由于核-壳结构的核具有磁性特性，可以对目标物AFP起到分离富集作用，极大提高对目标物的检测灵敏度。由此，所述核-壳结构磁性介孔二氧化硅纳米球磁分离并富集血清中目标物AFP，同时负载的双酶催化底物显色，通过生物偶联AFP捕获抗体，检测出AFP含量，生物标记过程简单且灵敏度高。所述磁性内核颗粒采用Fe₃O₄磁性纳米粒子。