[发明专利]一种用于捕获Poly A（+）RNA的磁珠、其制备方法及应用

说明书

本发明提供用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：将羧基磁珠、活化剂和5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到捕获Poly A(+)RNA的磁珠。本发明中的工艺较链霉亲和素‑生物素法可大幅降低成本、且磁珠稳定性好，不会引入外源污染源，耐受高温以及含变性剂等样本中Poly A(+)RNA的捕获。可实现操作过程的高通量、自动化、捕获效率高、操作简单、无需昂贵设备等优点。本发明还提供了一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠及其应用。

技术领域

本发明属于分子诊断领域，尤其涉及一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠、其制备方法及应用。

背景技术

信使RNA(Messenger RNA,缩写mRNA)，是由DNA的一条链为模板转录而来的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。真核生物的mRNA是单顺反子，其最显著的特征是具有5'端帽子结构和3'端的poly A的结构，即Poly A(+)RNA。所以可以利用碱基配对原理，将Oligo dT探针偶联到固相载体上，当含mRNA的样品(总RNA或细胞裂解物)与之孵育时，mRNA的poly A尾即被特异性的结合到固相载体上，从而将其与其它Poly A(-)RNA、蛋白等杂质分开，从而达到mRNA特异性分离与富集。尤其随着mRNA疫苗的兴起，以及NGS转录组测序需求大幅提升，市场上对poly A(+)mRNA捕获纯化需求越来越多。

目前Poly A(+)RNA的纯化有多种方法，如超速离心法、免疫法，柱层析法。目前市面上纯化Poly A(+)RNA的方法应用最广泛的为层析柱法，包括阴离子交换层析柱法，但此方法相较回收率较低、应用较少。另一种为亲和层析柱法，此方法应用较广泛，回收率较高，但相较磁珠法，操作时间长、无法实现完全的自动化、高通量，且需要昂贵的设备，无法实现一次实验进行两次结合以达到更高的纯度。磁珠法应用于生物活性物质的捕获与富集等领域越来越普遍，可实现Poly A(+)RNA的全自动、高通量、高纯度捕获。

磁珠(也称，磁性微球)一般是指是直径大小为微米或纳米级别的超顺磁颗粒。磁珠可以通过外加磁场进行控制，实现处理过程的自动化；磁珠粒径小，具有较大的比表面积；磁珠具有丰富的表面材质和功能基团，易于进行生物修饰、偶联等，从而广泛应用于生物活性物质(例如，核酸、蛋白、细胞)的富集、分离与捕获、免疫检测、药物筛选、疾病的诊断和治疗等领域。

但市面上大多数采用链霉亲和素磁珠搭配生物素标记的Oligo dT(寡聚胸腺嘧啶脱氧核糖核酸)探针，来实现Poly A(+)RNA的亲和捕获，但此方法成本高、稳定性较差，不适用于含蛋白变性剂的样本以及重复再生使用等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠、其制备方法及应用，本发明中的磁珠稳定性好，不会引入外源污染源，耐受高温以及含变性剂等样本中Poly A(+)RNA的捕获。可实现操作过程的高通量、自动化、捕获效率高、操作简单、无需昂贵设备等优点。

本发明提供一种用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠的制备方法，包括以下步骤：

将羧基磁珠、活化剂和5’端伯氨基修饰的Oligo dT探针在偶联缓冲试剂中混合，在室温下反应16～20小时，得到用于捕获Poly A(+)RNA的磁珠。

优选的，所述磁珠的外层为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、琼脂糖或葡聚糖；

所述磁珠的粒径为100nm～150μm。

优选的，所述磁珠的浓度为5～100mg/mL。

优选的，所述活化剂为碳二亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的一种或几种；

所述活化剂的浓度为10～100mg/mL。