[发明专利]一种β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种β‑丙氨酸生产菌、构建方法及应用。所述β‑丙氨酸生产菌是以E.coli W3110为出发菌，将其基因组中的panD基因的启动子替换为Trc启动子，导入整合了Bacillus subtilis来源panD的pTrc99A‑panD质粒，并增强ppc基因的表达，和敲除pykA和aspA后所得。本发明构建所得β‑丙氨酸生产菌在补料发酵过程中，β‑丙氨酸产量可达29.35g/L，为后续高产β‑丙氨酸工程菌的构建奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用，属于代谢工程领域。

背景技术

β-丙氨酸（3-氨基丙酸）是一种非蛋白质氨基酸，存在于所有生物中。β-丙氨酸作为泛酸的重要组成部分，是辅酶A和酰基载体蛋白合成的前体。以往的研究表明，在微生物体内，缺乏β-丙氨酸合成途径是致命的，因为不能合成辅酶A。另外，β-丙氨酸也可作为补品，被体内吸收后，可与组氨酸偶联形成二肽，在人体肌肉和脑组织中起重要作用。因此，β-丙氨酸广泛应用于药物(如帕米膦酸和胍丙酸和巴尔)、饲料和食品添加剂等领域。

目前β-丙氨酸的合成方法主要有化学催化法、酶法和微生物发酵法，其中化学催化法是工业生产β-丙氨酸的主要方法。然而，以丙烯酰胺、丁二酰亚胺或β-氨基丙腈为原料的化学催化法，由于环境和社会的压力，是不可持续的。因此，利用酶法和微生物发酵法生产β-丙氨酸，引起了学者的兴趣。目前，许多生物的ADC被表征，然后被用于酶法生产β-丙氨酸。虽然酶法合成β-丙氨酸取得了很大进展，并初步满足了工业应用的需要，但微生物发酵法仍是一种很有前途的工业生产方法。β-丙氨酸是以草酰乙酸和富马酸为前体合成的天门冬氨酸衍生物。在大肠杆菌中，草酰乙酸和富马酸可以通过三羧酸循环的还原/氧化分支来合成。因此通过TCA循环的还原途径合成β-丙氨酸在理论产量和能量消耗方面更有优势。

发明内容

本发明的目的提供一种β-丙氨酸生产菌、构建方法及应用，满足β-丙氨酸工业应用的需要。

为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种β-丙氨酸生产菌，由如下方法构建获得：

（1）以E. coli W3110为出发菌，将其基因组中panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株E. coli W3110/Trc-panD，记为ALA1；

（2）将源自Bacillus subtilis的外源基因panD整合入质粒pTrc99A中，得到质粒pTrc99A-panD；将质粒pTrc99A-panD导入ALA1中，增强panD基因的表达，得到重组菌株ALA1/pTrc99A-panD，记为ALA2；

（3）将ALA2基因组中的ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到重组菌株ALA2/Trc-ppc，记为ALA3；

（4）将ALA3基因组中的pykA基因敲除，得到重组菌株ALA3/△pykA，记为ALA4；

（5）将ALA4基因组中的aspA基因敲除，得到重组菌株ALA4/△aspA，记为ALA5，即为所述β-丙氨酸生产菌。