[发明专利]一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了枯草芽孢杆菌WS9的丙氨酸消旋酶基因dal，构建了D‑丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌WS9DAL。以枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌WS9DAL为表达宿主，构建了三株表达麦芽糖淀粉酶的基因工程菌WS9DAL1，WS9DAL2和WS9DAL3。在无抗生素添加的条件下，对三株基因工程菌进行摇瓶发酵培养，发酵培养60h时MAase酶活分别达到714U/mL，519U/mL和892U/mL。

技术领域

本发明涉及一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为芽孢杆菌属中的模式生物，是芽孢杆菌属中最早被用作基因工程表达宿主的菌种。枯草芽孢杆菌是一种食品安全菌种，被美国食品和药物管理局列为原则上认为安全的微生物(GRAS)。枯草芽孢杆菌作为外源蛋白表达宿主具有一些优良的性质：非致病性，蛋白分泌能力较强，遗传背景清晰，密码子没有明显偏好性，发酵培养简单，被广泛的用于外源蛋白的表达。

筛选标记是对微生物菌株进行遗传改造所必需的重要工具，枯草芽孢杆菌遗传改造中常用的筛选标记主要为抗生素抗性筛选。目前大量研究结果显示，人们使用抗生素造成的危害日益明显。环境中残留的抗生素不仅污染环境，更会危害人类的健康。此外，与抗生素抗性筛选相比，利用功能互补的营养缺陷型筛选标记具有生物安全性高，假阳性率低的优势，在食品及饲料工业对于重组蛋白的生产具有更广泛的应用。因此，开发无抗性筛选标记并将其用于构建食品安全菌种对于实现食品领域蛋白的生产具有重要的应用价值。

发明内容

本发明提供了一种食品安全的枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了枯草芽孢杆菌WS9的丙氨酸消旋酶基因dal，减少了菌株WS9生长代谢过程中D-丙氨酸的产生，使其仅在外源D-丙氨酸存在的条件下才能正常生长。

在一种实施方式中，所述丙氨酸消旋酶基因dal的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌WS9菌株是利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了枯草芽孢杆菌WS的srfC，spoIIAC，amyE，nprB，nprE，aprE，bpr，mpr和epr这9个基因，减少了发酵过程泡沫、芽孢、胞外淀粉酶和蛋白酶的产生；所述枯草芽孢杆菌WS9公开于论文《枯草芽孢杆菌菌株改造、启动子优化和普鲁兰酶的高效制备研究》中。

在一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌WS9DAL的构建方法为：

(1)设计用于敲除基因dal的sgRNA双链寡核苷酸序列，根据靶序列sgRNA软件设计出一系列的sgRNA，选取其中一个脱靶率低的，并且在阅读框前面的作为sgRNA，以质粒PHY300dsrf为模板，PCR扩增获得替换sgRNA后的质粒PHY300d；

(2)以枯草芽孢杆菌WS9基因组为模板，PCR扩增丙氨酸消旋酶基因dal的同源修复臂上游片段、同源修复臂下游片段，并通过重叠PCR将上游片段和下游片段连接起来，得到完整的同源修复臂；所述同源修复臂是根据靶序列设计的，缺失了靶基因序列中的938个碱基，造成阅读框的缺失突变；

(3)将步骤(2)构建的同源修复臂片段通过重组酶连接到步骤(1)构建的载体PHY300d上，再转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子，并验证转化子，得到敲除质粒PHY300ddal；

(4)将步骤(3)构建的敲除质粒PHY300ddal利用化学转转化法转化至枯草芽孢杆菌WS9，通过菌落PCR筛选转化子，验证正确的转化子为带有敲除质粒PHY300ddal的dal敲除菌株；