[发明专利]一种植物来源外泌体的中试提取方法及其应用

权利要求书

1.一种植物来源外泌体的提取方法，其特征在于，所述方法包括：取植物材料，加入缓冲液经震荡，使植物材料中的外泌体释放到缓冲液中，离心，收集上清，通过微滤中空纤维柱进行微滤除杂，通过超滤中空纤维柱进行超滤浓缩，获得所述植物来源外泌体；

其中，所述缓冲液为PBS缓冲液、HBSS、DPBS、复方氯化钠注射液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述震荡的条件选自如下特征中的一个或多个：

(a)以植物材料的初始质量为准计算缓冲液的加入量，其中所述植物材料的初始质量(g)与缓冲液的体积(mL)比值为1:1～1:5；

(b)所述震荡的温度为15℃～30℃；

(c)所述震荡的时间为18-48小时；

(d)所述震荡的转速为50-150rpm；

(e)所述震荡在通气环境下进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心的条件为：

(a)所述离心的转速为2000-20000rpm；和/或，

(b)所述离心的时间为10-60min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微滤中空纤维柱的过滤精度为0.1-0.8um。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超滤浓缩的条件选自如下特征中的一个或多个：

(a)采用100-500kDa超滤中空纤维柱进行超滤浓缩；

(b)所述超滤浓缩是指浓缩至原微滤后获得的液体体积的1/10-1/20；

(c)所述超滤浓缩后还包括超速离心纯化的步骤，所述超速离心的参数为4℃，140000g，60-120min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述震荡前还包括均质获得均质液，去除死细胞、细胞残渣的步骤；

其中，所述均质是指将植物材料粉碎成直径1厘米以下的碎片；

其中，所述去除死细胞、细胞残渣的步骤通过将所述均质液经纱布过滤、梯度低速离心或滤膜过滤中的一种或几种方式实现。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述超滤浓缩后还包括沉淀、重悬和分装的步骤，包括如下特征中的一个或多个：

(a)所述沉淀是指，所述浓缩液与PEG8000/NaCl混匀后，在2-8℃条件下沉淀；

(b)所述浓缩液与PEG8000/NaCl的体积比为3:1-8:1；

(c)所述离心转速为2000-8000rpm；

(d)所述离心的时间为5-40min；

(e)在重悬后，包括过滤除菌的步骤，所述过滤除菌采用0.22-0.45um滤膜实现；

(f)在重悬后，包括在重悬液中加入海藻糖然后冻干的步骤，所述海藻糖的浓度为5-10％。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)清洗

取植物材料，进行清洗；

(2)均质

将所述植物材料粉碎，进行均质，获得均质液；

(3)过滤

过滤均质液，去除死细胞和/或残渣；

(4)震荡

向经步骤(3)处理后的均质液中加入缓冲液，震荡，使外泌体释放到缓冲液中；同时，细胞在培养过程中，植物细胞会继续产生大量外泌体；

(5)离心

将震荡后的混合液离心，收集上清液；

(6)微滤除杂

采用微滤中空纤维柱去除上清液中的细胞或细胞碎片；

(7)超滤浓缩

采用超滤中空纤维柱对外泌体进行浓缩；

(8)重悬

向所述浓缩液中加入PEG8000/NaCl，混匀，4℃放置；

(9)重悬、分装

离心，收集沉淀，用生理盐水重悬，分装。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法获得的植物来源外泌体。

10.根据权利要求9所述的植物来源外泌体在制备日化用品或药品中的应用。