[发明专利]生产己二胺的重组质粒及其应用

说明书

本发明涉及生物工程领域，具体公开了一种生产己二胺的重组质粒及其应用。本发明通过重构微生物的α‑酮酸、脂肪酸、亮氨酸等途径，构建同源或异源的延伸途径，实现廉价可再生底物的“+n”基团的叠加。通过对α‑酮酸途径与亮氨酸合成途径的整合，以乙酰辅酶A为叠加单体，L‑赖氨酸为原料，实现碳链的可控延长，由此可以实现尼龙材料单体己二胺的合成。结合基因组、代谢组学分析，和计算机模拟计算，拟通过对亮氨酸途径的定向进化，从而实现己二胺的高产，并且可定向生产其他链长的胺类物质生产。整合赖氨酸生产菌株，最终赋予细胞新的合成代谢能力，获得能从头合成聚酰胺类材料单体的工程细胞，实现生物基化学材料的生产。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及生产己二胺的重组质粒及其应用。

背景技术

随着对医药化学品、材料单体、合成聚合物的需求的逐年增加，由此引起的原料枯竭、环境污染、高成本等问题日益严重。微生物介导的化学生产的出现将提供从依赖矿物燃料到可持续的社会的发展机会。

体内碳链延长则是一种有巨大潜力的途径，可以用来合成不同链长的同类酸类、醇类物质，这些都是生物燃料和材料的重要组成物质，且具有从可再生且廉价的原材料生产生物基产品的巨大价值。

尼龙是最常见的聚酰胺材料之一，其材料单体己二胺(Hexamethylene diamine)的合成是“卡脖子”技术，传统从己二睛的生产技术将产生大量的温室气体，且由于对化石油的依赖使得生产不可再生。因此，从可再生碳源微生物生产化学物质和材料对于建立可持续的化学工业变得至关重要。在过去的几十年里，生物、化学的组合方法已用于生产越来越多的化学药品，L-赖氨酸是一种重要的商品氨基酸，在全球范围内具有数百万吨的生产能力，可以通过基因工程改造的谷氨酸棒杆菌或重组大肠杆菌通过微生物发酵来生产。

目前基于己二胺的生物合成法仅有Alexander F.Yakunin教授以己二酸为底物，通过脱羧转氨实现己二胺的生产。但该路径依旧产量低下，受到底物己二酸的生产能力的限制。另外，专利CN112079725A公开了一种生产己二胺的方法：将氨气、氢气与己内酰胺混合气化后，得到混合气；向所得混合气中加入催化剂，进行催化氨化反应和催化加氢反应；然后，对反应所得物料进行冷凝分离得到反应液，将所得反应液进行蒸馏，得到己二胺。虽然该方法在一定程度上简化了生产步骤，但是其工艺还是较为繁琐，添加物料较多，工艺对温度要求较高。

综上，缺乏一种高产的己二胺的生物合成法，降低成本的同时更加绿色环保，实现生物基化学材料的生产。

发明内容

本发明为了解决上述问题，本发明提供了两组产己二胺的重组质粒和两种产己二胺的基因工程菌，同时提供两组重组质粒组合物以及对应基因工程菌的构建方法，提供两组重组质粒以及基因工程菌在细胞发酵、细胞催化、酶催化生产己二胺的用途。

本发明目的之一在于提供一种能辅助生产己二胺工程菌的重组质粒，所述重组质粒为pRLABCD重组质粒，所述重组质粒包括raip基因、leuA基因、leuB基因，leuC基因和leuD基因。

具体的，所述raip基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

具体的，所述pRLABCD重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明目的之二在于提供上述pRLABCD重组质粒的制备方法，具体技术方案如下：

上述pRLABCD重组质粒的制备方法，具体步骤：

(1)设计引物：

raip-F:cggaattcgatggagcacctggcagact；

raip-R:caactgcagttacagttcgtccttggtatgctcg；