[发明专利]一种自融合串联蛋白修饰方法及其应用

说明书

本发明公开了一种简单但通用的蛋白质修饰方法，自融合串联(self‑fused concatenation，SEC)蛋白修饰方法，以提高蛋白的生物活性和药学性质。本发明通过基因工程技术获得了一组GFP单体、GFP二聚体和GFP三聚体。GFP多聚体能显著提高GFP单体的体外生物活性、热稳定性和小鼠肿瘤的滞留时间，且蛋白生物活性、热稳定性和肿瘤滞留时间与自融合串联蛋白的数量呈正相关。此外，本发明通过SEC技术合成IFN单体、IFN二聚体和IFN三聚体，IFN多聚体能显著提高IFN单体的体外生物活性、体内半衰期和抗肿瘤效果。以上结果说明SEC可作为一种选择，代替现有PEG化或者白蛋白融合技术，广泛应用于其他的蛋白或小肽药物来提高其药理学特性，成功设计长效蛋白或多肽药物。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及自融合串联蛋白修饰方法的开发及其在蛋白修饰中的应用。

背景技术

与小分子药物相比，蛋白质和多肽具有高特异性和低毒性，在临床上具有很大的医学治疗潜力。目前已有多种FDA批准的治疗药物(如依那西普、甘精胰岛素、培氟沙星、比伐卢定、环孢素和奥曲肽等)已在肿瘤、免疫、病毒性疾病和内分泌疾病等领域得到应用。然而，蛋白质和多肽存在稳定性差、免疫原性强、半衰期短等问题。

目前已经开发了许多策略来部分解决上述问题并提高蛋白质/多肽的递送效率。例如，将无毒高分子聚乙二醇(PEG)共价结合到蛋白质上，可以有效延长循环半衰期并增加蛋白质的稳定性，这种方法叫做PEG化技术。目前已有许多PEG化的蛋白药物，如PEG-干扰素α-2a、PEG-L-天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶、PEG-尿酸酶和PEG-肿瘤坏死因子α、PEG-促红细胞生成素受体激活剂等已在临床上得到应用，与未修饰的蛋白相比表现出更好的药物特性。另一种白蛋白融合技术，通过将蛋白质与半衰期长的血清白蛋白(HSA)或Fc片段融合，已成功用于IFNα、抗血友病因子(AHF)、重组因子IX(F9)、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)和抗血管内皮生长因子(抗VEGF)的修饰并有效延长体内循环半衰期。然而，无论是很成熟的PEG化技术还是HSA和Fc融合，均需要引入外源大分子进行修饰，这有可能导致免疫原性、降低蛋白生物活性及其他潜在的毒性作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何使蛋白质在生物体内的半衰期延长和/或活性保持率增加，同时不引入外源分子。

首先，本发明提供一种自融合串联蛋白修饰方法，其为将编码蛋白的基因串联后在蛋白表达系统中进行表达，并对表达的多聚体进行纯化。

其中，所述蛋白表达系统包括但不局限于原核表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体。

其中，所述蛋白为荧光蛋白，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白及其衍生物。

其中，所述蛋白为干扰素，所述干扰素选自干扰素α、干扰素β、干扰素γ、干扰素λ中的一种或多种。