[发明专利]实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的PCR引物探针组、试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一组实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的PCR引物探针组，包括弓形体529基因的上游引物TG‑529‑F、下游引物TG‑529‑R和弓形体特异性荧光探针TG‑529‑P，附红细胞体16SrRNA的上游引物ES‑F、下游引物ES‑R和附红细胞体特异性荧光探针ES‑P。在该引物探针组基础上组装的双重荧光定量PCR试剂盒，能够同时检测猪弓形体病和附红细胞体病，具备高灵敏性、高特异性、稳定性和准确性的优势，且可一次性检测出混合感染，为一线猪场临床弓形体病和附红细胞体病的早期诊断和防控监测工作提供可靠的技术和产品。

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，尤其涉及一种实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的双重PCR引物探针组与试剂盒，以及PCR试剂盒的检测方法。

背景技术

弓形体病是由刚第弓形虫引起的一种人畜共患寄生虫病，可通过口、眼、鼻、呼吸道、肠道、皮肤等途径侵入猪体。病猪会出现高热、淋巴结肿大、头、耳、下腹部有淤血斑或发绀等症状；怀孕母猪则出现流产、死胎和畸胎等症状。附红细胞体病是附红细胞体寄生在猪或人红细胞内并通过媒介传播的人兽共患病，可造成猪发热、贫血、黄疸以及耳尖、四肢和腹下出血等临床症状。不同品种和日龄猪对弓形虫和附红细胞体均易感，其中以仔猪和怀孕母猪受到的危害最严重，可导致猪只死亡。猪弓形体病和附红细胞体病在临床上常呈混合感染，不仅导致畜产品质量和产量降低，动物生育能力下降，而且增加了治疗成本，给我国养猪业造成了严重的经济损失。因此除了对猪群加强程序化免疫外，在发病前早期诊断，早期用药显得十分必要。

猪弓形体病的诊断方法有直接涂片或组织切片法、动物试验法、ELISA 等，这些方法在检测操作与检测结果方面都或多或少存在不足，无法有效做到疾病爆发前的早期诊断。随着生物技术的发展，应用荧光定量PCR和核酸分子杂交技术对弓形体病进行诊断越来越受到科学家的重视，且荧光定量 PCR检测方法可弥补免疫学方法因抗体滴度低而无法检出的不足。

附红细胞体病的诊断方法可通过直接镜检进行诊断，但假阳性率高；动物试验法耗时较长、费用高；血清学方法因附红细胞体的抗体变化起伏较大而不适用；普通PCR法在实际应用中会出现非特异和稳定性差的现象；随着核酸技术的发展，荧光定量PCR法则具有实时、灵敏和安全等优点，且准确性高。

目前已存在一些利用荧光定量PCR方法对这两种病原进行检测的报道和一些检测试剂盒，但都是对单一病原的检测，因此亟待建立一种可以同时并快速检测猪全血中弓形体和附红细胞体的方法及检测产品。

发明内容

为解决现有技术存在的不足，本发明设计了一组实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的PCR引物探针组，利用该引物探针组对猪弓形体病和附红细胞体病同时进行荧光定量检测，具备高灵敏性、高特异性，高准确度且快速的优势，为一线猪场临床弓形虫病和附红细胞体病的早期诊断和防控监测工作提供可靠的技术和产品。

为实现上述目的，本发明提供的实时荧光定量检测猪全血弓形体和附红细胞体的PCR引物探针组，包括弓形体529基因的上游引物TG-529-F、下游引物TG-529-R和弓形体特异性荧光探针TG-529-P，附红细胞体16SrRNA的上游引物ES-F、下游引物ES-R和附红细胞体特异性荧光探针ES-P；

上游引物TG-529-F:5’-GCCACAGAAGGGACAGAAGTC-3’，其为SEQ ID NO:1序列；

下游引物TG-529-R：5’-GAAAAGCAGCCAAGCCGGAAA-3’，其为SEQ ID NO:2序列；

弓形体特异性荧光探针TG-529-P: FAM-5’-CGCTTCCCAACCACGCCACCCTCTCAT-3’-BHQ1，其为SEQ ID NO:3序列，其中5’端标记有FAM荧光报告基因，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基因；

上游引物ES-F:5’-ATATGACTGAATCGTAAGATCTAGG-3’，其为SEQ ID NO:4序列；