[发明专利]羰基还原酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及生物化工领域，公开了一种羰基还原酶突变体及其应用，本发明通过将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第143位亮氨酸突变为丙氨酸，136位亮氨酸突变为丙氨酸以及135甘氨酸突变为异亮氨酸，使得羰基还原酶突变体的酶活提高8倍，且e.e.值提高到了99%，与甲酸脱氢酶偶联成功实现了辅酶循环，最终在菌体终浓度为20 g（dcw）/L能将450 g/L的底物在12 h之内转化率以及e.e.值均在99%以上，有效解决了底物浓度不高、转化率低、产率低以及e.e.值低以及生产成本较高等问题。

技术领域

本发明涉及生物化工领域，尤其涉及了一种羰基还原酶突变体、基因以及含有该基因的重组载体和重组载体转化制备的重组基因工程菌，以及羰基还原酶突变体在催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯合成（S）-6-羟基-8-氯辛酸乙酯中的应用。

背景技术

硫辛酸(α-Lipoic acid)是一种具有生物活性的天然产物，1951年由Reed首次从猪肝中分离得到。硫辛酸在欧美已广泛地用于临床医学领域，如肝病、老年痴呆、白内障、心脏病、糖尿病、艾滋病、牛皮癣、湿疹、帕金森氏症、风湿病、心脏病、神经性疾病、亚急性坏死脑病、放射性伤害症、重金属中毒等疾病的治疗，被誉为“万能抗氧剂”。

随着硫辛酸的药理药效学的深入研究发展，医学界研究人员对各种硫辛酸的衍生物及其它们盐类进行了应用开发，极大的丰富和扩展了硫辛酸系列产品的适应症范围和治疗效果，以满足医药临床和市场需求。

硫辛酸含有一个手性中心，研究表明，硫辛酸的两个对映异构体，R-型对映体具有生物活性，而S-型对映体基本没有活性，亦没有毒性，显然，R-型对映体具有更高的应用价值。

6-羟基-8-氯辛酸乙酯为合成硫辛酸的重要中间体，过去近 30 年间，以单一构型的6-羟基-8-氯辛酸乙酯出发通过氯代、硫化环化以及构型反转后得到（R）-α-硫辛酸具有高立体选择性以及相对较高的收率的，为目前工业生产（R）-α-硫辛酸的主流路线。

其中，6-羟基-8-氯辛酸乙酯的不对称合成方法主要包括化学合成法以及生物法，但是化学合成中复杂的反应过程以及普遍存在的立体选择性不足需要后续拆分提高e.e.值等，生物法中通过脂肪酶的动力学拆分的理论收率不超过50%，这些大大增加了（R）-α-硫辛酸的生产成本，限制了他们的应用价值。单一构型的6-羟基-8-氯辛酸乙酯通过还原酶进行不对称合成理论产率可达到100%，越来越受到研究者的青睐。

目前已有的还原酶法不对称合成单一构型6-羟基-8-氯辛酸乙酯报道中，存在底物浓度较低（45 g/L）且转化率只有95%，e.e.值未提及以及需要添加昂贵的辅酶（WO2007028729）。

专利公告号为CN103451124B，专利名称为一株红球菌以及用于制备光学纯（R）-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途的中国发明专利中公开了用其制备（R）-6-羟基-8-氯辛酸乙酯在底物浓度为66 g/L下转化率为99%但e.e.值仅为93%。

2020年，Xu等从Candida parapsilosis中筛选出羰基还原酶突变体CpAR2S131Y/Q252I，并构建了pAR2S131Y/Q252I/BmGDH工程菌，使得羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶GDH在同一个菌株中共表达，最终在110 g/L的底物浓度下产率85%，e.e.值为99% （10.1002/cbic.201900693）为目前较高水平，但其底物浓度、转化率、产率以及e.e.值仍有待提高。

发明内容

本发明针对现有技术中还原酶法不对称合成单一构型6-羟基-8-氯辛酸乙酯制备（R）-α-硫辛酸过程中存在的问题，提供了一种羰基还原酶突变体、重组载体、重组基因工程菌及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：