[发明专利]一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备及使用方法

权利要求书

1.一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于：所述犬冠状病毒化学发光检测试剂包括磁性微球-G19偶联物和G15-吖啶酯偶联物，具体制备过程包括如下步骤：

制备磁性微球-G19偶联物：采用EDC和NHS活化磁性微球，加入犬冠状病毒抗体G19震荡偶联，磁性微球封闭液封闭，磁力架中清洗磁性微球，然后在磁性微球缓冲液中进行保存，备用，得到磁性微球-G19偶联物。

制备G15-吖啶酯偶联物：将犬冠状病毒抗体G15与吖啶酯离心浓缩除去杂质，然后将G15与吖啶酯充分混匀进行标记偶联，在室温下轻轻震荡标记，加入发光封闭液封闭，透析除去未结合的吖啶酯；然后经过Sephadex G50凝胶层析柱纯化，保存在发光试剂缓冲液中备用，得到G15-吖啶酯偶联物。

2.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于：

所述制备磁性微球-G19偶联物步骤中，犬冠状病毒抗体G19震荡偶联4h，磁性微球封闭液封闭2h，磁力架中清洗磁性微球2次；所述制备G15-吖啶酯偶联物步骤中：按照4：1质量比将G15与吖啶酯充分混匀进行标记偶联，在室温下轻轻震荡标记2h，加入发光封闭液封闭1h。

3.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于：所述制备磁性微球-G19偶联物步骤中，采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)法将羧基磁珠活化后与G19偶联，以制得抗体磁珠。

4.根据权利要求3所述的一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于：所述制备磁性微球-G19偶联物步骤中，加入EDC和NHS，在37℃的恒温箱中振荡活化30min，加入犬冠状病毒抗体G19，37℃的恒温箱中振荡反应4h，磁性微球封闭液封闭2h，磁力架中清洗磁性微球2次，利用磁性微球缓冲液稀释后，置于4℃的冰箱中保存，备用。

5.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于：所述磁性微球封闭液采用0.05M Tris、0.05％酪蛋白、0.05％Triton X-100以及0.01％Proclin 300混合制成，且pH为7.8。

6.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于：所述磁性微球缓冲液采用0.05M Tris、1.5％海藻糖、1％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100以及0.01％Proclin300混合制成，且pH为7.4。

7.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于：所述发光封闭液采用0.01M PBS、0.15％赖氨酸和0.1％Proclin 300混合制成，所述封闭液pH为7.5。

8.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的制备方法，其特征在于：所述发光试剂缓冲液采用PBS、1％海藻糖、0.5％TrionX-100、0.1％Proclin 300和0.5％酪蛋白混合制成，且pH为6.3。

9.根据权利要求1所述的一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的使用方法，其特征在于：取犬呕吐物或粪便样本，用样本稀释液进行适当稀释，在透明的反应管中，依次加入稀释后的样本或者标准品或者质控品、磁性微球-G19偶联物，G15-吖啶酯偶联物，于室温下震荡孵育反应，随后在磁场作用下清洗，反应管进入检测暗室，采用全自动发光仪先后泵入底物激发液A和底部激发液B，最后在化学发光仪上读出各孔相对发光度RLU。

10.根据权利要求9所述的一种犬冠状病毒化学发光检测试剂的使用方法，其特征在于：在透明的反应管中，依次加入50μL稀释后的样本或者标准品或者质控品、30μL磁性微球-G19偶联物，40μLG15-吖啶酯偶联物；

所述底物激发液A为0.1M浓硝酸、0.15％过氧化氢和0.1％TrionX-100的混合物；

所述底物激发液B为0.35M氢氧化钠和2.5％TrionX-100的混合物。