[发明专利]一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法

说明书

本发明属于细胞生物学技术，具体涉及小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法。技术方案的具体步骤：（1）向雌性小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG；（2）用颈椎脱臼法处死小鼠，分离小鼠卵巢，PBS清洗，显微镜下去除其周围脂肪被膜；（3）在混合操作液中用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，筛网过滤，滤液离心弃上清；（4）混合完全培养基重悬细胞沉淀接种，操作液为DME/F‑12 1:1(1X)+3%胎牛血清+2%青链霉素混合液+2%支原体清除剂。进一步，小鼠采用3周龄，体重10‑13g，未成熟的雌性小鼠，PMSG的注射量为5‑10IU，注射方法为腹腔注射，PMSG的注射量优选为8IU，断颈处死小鼠时间是在注射后46‑48h后。本发明提供的机械法操作简便，耗时短，而且获得的卵巢颗粒细胞得率高。

技术领域

本研究属于细胞生物学技术，具体涉及一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法。

背景技术

卵泡主要由卵母细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞构成，颗粒细胞是卵巢中的一种体细胞，其在卵泡中的发育早于其他细胞，当其形态和数量达到一定水平，卵母细胞才开始发育，所以颗粒细胞是启动卵泡发育的关键因素。同时颗粒细胞表达各种促性腺激素受体进一步调节卵泡的生长和成熟，亦是卵泡闭锁的发起者。因此，颗粒细胞可作为研究女性及雌性动物生殖内分泌变化、生理功能调控及评估体外药效药理的良好细胞模型。目前有关体外分离对小鼠卵巢颗粒细胞的体外培养研究较少，且效果不稳定，本发明旨在提供一种简便廉效的小鼠卵巢颗粒细胞的分离培养方法。

发明内容

发明解决的技术问题：

本发明公开了一种小鼠卵巢颗粒细胞的分离及培养方法，包括步骤如下：注射PMSG后将小鼠断颈椎处死，取出卵巢，用PBS冲去血污；显微镜下去除其周围脂肪和被膜；在混合操作液中用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，收集后离心，用混合培养基重悬细胞。采用本方案可以很好的将颗粒细胞分离，且能获得较纯的颗粒细胞，具有切实可行，可操作性强，稳定可靠，重复性好等优点。

技术方案：

一种小鼠卵巢颗粒细胞提取及培养方法，具体步骤为：

（1）向雌性小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG；

（2）用颈椎脱臼法处死小鼠，分离小鼠卵巢，PBS清洗，显微镜下去除其周围脂肪和被膜；

（3）在混合操作液中用注射器针头刺破卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，筛网过滤，滤液离心弃上清；

（4）混合完全培养基重悬细胞沉淀接种，

操作液为DME/F-12 1:1(1X)+3%胎牛血清+2%青链霉素混合液+2%支原体清除剂。

进一步，小鼠采用3周龄，体重10-13g，未成熟的雌性小鼠。

进一步，PMSG的注射量为5-10IU，注射方法为腹腔注射。

进一步，PMSG的注射量为8IU。

进一步，断颈处死小鼠时间是在注射后46-48h后。

进一步，混合完全培养基为DMEM/F-12 1:1(1X)+15%胎牛血清+1%青链霉素（1:100）+1%支原体清除剂混合液。

更进一步，细胞首次换液时间为24-48h，以后每40-48h更换一次培养基。

有益效果：

本发明提供一种机械法获得小鼠卵巢颗粒细胞的方法，不仅操作简便，耗时短，而且获得的卵巢颗粒细胞得率高。

本发明还提供一种混合完全培养基培养卵巢颗粒的方法，成分简单，增加了卵巢颗粒细胞的生存期，大大降低细胞污染率。

附图说明

图1为采用本发明的方法提取培养的颗粒细胞FSHR染色鉴定（x100）。