[发明专利]一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法

说明书

本发明提供了一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法。所述方法包括如下步骤：1、去泛素化酶检测探针的制备，包括制备融合蛋白Ub‑linker‑Cys、连接BODIPY探针、质谱检测；2、检测去泛素化酶的活性，包括选择去泛素化酶、去泛素化对探针FP值的影响、实时检测去泛素化酶的活性。该检测方法是基于检测荧光偏振，荧光偏振检测的是平行方向和垂直方向荧光强度的比例关系，其不易受荧光探针的浓度、溶液温度和pH以及其他荧光信号的干扰，在测量去泛素化酶的活性时，步骤简单、耗时短，且探针和去泛素化酶的用量少。此外，该方法中制备的探针也可用于去泛素化酶抑制剂的筛选，且是高通量的。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及到一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法。

背景技术

泛素化修饰广泛存在于真核细胞中，泛素（Ubiquitin, Ub）所形成的“泛素密码”几乎可以调控所有的生理过程。泛素化修饰也是可逆的，泛素可被去泛素化酶（deubiquitinase, DUB）从底物或者泛素链中分解释放出来。去泛素化酶在泛素-蛋白酶体通路、自噬通路等都起着调控作用，很多神经退行性疾病、肿瘤也与去泛素化酶有关，所以去泛素化酶是非常重要的药物靶点。检测去泛素化酶的活性是研究其生物学功能的重要途径，也是药物筛选的必要手段。目前，检测去泛素化酶活性的主要方法如下：通过检测蛋白质的分子量（SDS-PAGE或者Western blot）来研究去泛素化酶的活性（Peterson LF等，Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 2015, 125(23):3588-3597）。泛素不仅可以形成各种不同的泛素链，也可共价连接到底物蛋白上去，去泛素化酶可将泛素链、以及底物上的泛素（链）降解，通过SDS-PAGE或者Western blot来检测泛素链或者底物分子量的变化，从而检测去泛素化酶的活性。该方法存在费时费力，一般只能做定性分析等缺陷。此外，在去泛素化酶抑制剂筛选方面，该方法难以实现高通量筛选。

目前，现有技术中已有基于稳态荧光的测定方法来检测去泛素化酶的活性，如利用7-氨基-4-甲基香豆素标记泛素蛋白 (Ub-AMC)，或罗丹明110标记泛素蛋白 (Ub-Rho)。这些标记蛋白可作为底物被各种去泛素化酶有效裂解或水解，释放出荧光的部分，该方法已被广泛用于去泛素化酶活性的检测（Jiao L等，Protein cell, 2014, 5(8): 616-630）。但是，上述方法所用的检测探针不仅价格昂贵，且在用于去泛素化抑制剂筛选时有一个显著的缺点，其检测的荧光容易受到许多小分子表现出的荧光所干扰。

陈云飞等人开发了Ub-Nanoluc和Ub-Ub-GS-Nanoluc报告基因系统来检测去泛素化酶的活性（专利号：CN104844704A），其技术特点是将Ub-Nanoluc或者Ub-Ub-GS-Nanoluc融合蛋白固定在固相介质上，然后加入去泛素化酶将Nanoluc荧光素酶释放，离心除去固相介质以及介质上融合蛋白，在上清液中加入Nanoluc底物检测Nanoluc发光，从而可测得去泛素化酶的活性。该方法存在以下几个问题：1）该方法是通过His-tag来固定融合蛋白的，His-tag和固相基质的结合强度有限很容易脱落下来从而影响检测结果；2）将探针的一端固定在介质上，因固定产生的空间位阻可能会影响去泛素化酶对探针的降解；3）该方法用于去泛素化酶抑制剂筛选时，由于Nanoluc荧光素酶是一个分子量为19.1 kDa的蛋白质，某些小分子可能会与Nanoluc相互作用干扰其活性测量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于荧光偏振（Fluorescence Polarization，FP）的去泛素化酶活性检测方法。本发明所需解决的技术问题是：制备探针——Ub-linker-BODIPY，并将该探针用于去泛素化酶的活性检测。该探针是基于荧光偏振来检测去泛素化酶活性的，具有探针用量少、检测灵敏度高，不易受探针浓度和其他荧光信号干扰等优点。