[发明专利]一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法

权利要求书

1.一种基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

（1）去泛素化酶检测探针的制备：①制备融合蛋白Ub-linker-Cys：将Ub-linker-Cys的基因序列克隆到pET11a载体上(Novagen)，酶切位点为NdeI和BamHI，以BL21 star为表达宿主，对该融合蛋白进行表达，当OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为200-1000μM IPTG ，在温度为25-37°C诱导3-6小时，在纯化Ub-linker-Cys融合蛋白时，依次用P Seoharose FastFlow, Sephacryl S100以及Source-S columns进行纯化获得高纯度的蛋白，融合蛋白Ub-linker-Cys的氨基酸序列以及基因序列分别见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；②连接BODIPY探针：BODIPY-maleimide探针的连接为现有技术，将Ub-linker-Cys蛋白置换到浓度为20mM 磷酸盐缓冲液中,缓冲液的pH 为7.2-8.0，以摩尔比1:2-1:5分别加入蛋白质和BODIPY探针，室温反应1-3小时，然后通过Source-S columns进行纯化，连接上荧光探针的样品在280 nm、544 nm处均有吸收；③质谱检测：通过质谱对制备的Ub-linker-Cys融合蛋白进行检测，其检测结果与理论分子量10875.3 Da相一致，利用质谱对连接BODIPY探针后的样品进行检测，其质谱检测结果为11437.72 Da，该值正好为Ub-linker-Cys与BODIPY-maleimide分子量之和，BODIPY-maleimide的理论分子量为562.42 Da，这表明BODIPY探针连接成功；

（2）检测去泛素化酶的活性：①选择去泛素化酶：根据氨基酸序列的保守性，现有的去泛素化酶分为6大家族，分别是USPs、UCHs、MJDs、OUTs、MINDYs和JAMMs，Ub-linker-BODIPY探针几乎能用于所有去泛素化酶的检测；②去泛素化对探针荧光偏振值（FP）的影响：选择待检测的去泛素化酶，活性检测的缓冲条件与待测去泛素化酶的缓冲条件是一致的，以1:10-1:100的比例加入去泛素化酶和Ub-linker-BODIPY探针，探针的浓度为0.5-5 μM，在待测去泛素化酶的最适反应温度下进行保温直至去泛素化反应完成，利用荧光光谱仪检测探针的荧光偏振值（FP），同时，在相同的缓冲条件下，加入相同浓度的Ub-linker-BODIPY探针作为对照，并检测其荧光偏振值（FP）；③实时检测去泛素化酶的活性：在待检测去泛素化酶的缓冲溶液中，加入0.5-5μM Ub-linker-BODIPY探针，并以摩尔比为500:1-50:1加入去泛素化酶，利用荧光光谱仪多次连续地检测反应体系的荧光偏振值（FP），检测的时间间隔为1-5分钟，在荧光偏振值（FP）检测时，激发波长和发射波长分别设置为544 nm和573 nm，狭缝宽度设为3-5 nm。

2.根据权利要求1所述的基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中的融合蛋白Ub-linker-Cys的氨基酸序列如表中SEQ ID NO.1所述。

3.根据权利要求1所述的基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法，其特征在于：所述方法步骤（1）中的融合蛋白Ub-linker-Cys的基因序列如表中SEQ ID NO.2所述。

4.根据权利要求1所述的基于荧光偏振的去泛素化酶活性检测方法的用途，其特征在于：所述方法能用于去泛素化酶抑制剂的筛选。